技术领域本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定超氧化物歧化酶的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶（SOD），别名肝蛋白，简称SOD,是一种源于生命体的活性物质，是一种金属酶，含有铜和锌两种离子，需氧,生物中，SOD催化使对抗体有关的超氧阴离子变成双氧水，随后被双氧水分解，保护机体免受超氧阴离子的影响，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。超氧化物歧化酶在生物界分布极广，几乎从动物到植物，从人到单细胞生物，都有它的存在,SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫,能清除具有毒性而损坏细胞的超氧阴离子自由基，提高免疫力，使机体免受炎症、肿瘤的侵犯，而延缓机体的衰老。目前超氧化物歧化酶的检测方法主要有化学发光、酶联免疫吸附法，化学发光检测成本较高，且需要使用的机器价位昂贵，大量普及有一定的困难，酶联免疫吸附法操作复杂，耗时长，且对操作人员有一定的专业技能要求，另外测量的准确度也不高。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺陷，而提供一种测定超氧化物歧化酶的试剂盒及其制备方法。本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定超氧化物歧化酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：HEPPS缓冲液10~140mmol/L叠氮钠0.1~0.9g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚0.5~3.5mmol/LEDTA1~20mmol/L其溶剂为纯化水。作为优选，本发明公开了一种测定超氧化物歧化酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：HEPPS缓冲液75mmol/L叠氮钠0.5g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚2.0mmol/LEDTA10.0mmol/L其溶剂为纯化水。作为优选，所述的试剂R1中，所述的HEPPS缓冲液的pH值为6～9。作为优选，本发明还公开了上述测定超氧化物歧化酶的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：（a）按照下列组分含量配制好试剂：试剂R1：HEPPS缓冲液10~140mmol/L叠氮钠0.1~0.9g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚0.5~3.5mmol/LEDTA1~20mmol/L其溶剂为纯化水；（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；（d）根据吸光度变化值计算出样本中的超氧化物歧化酶的浓度。本发明的检测原理是：邻苯三酚在碱性环境中，会产生自氧化显色反应，在其自氧化过程中不断释放超氧阴离子自由基（O2-），自氧化显色反应强度高时释放出的自由基（O2-）浓度就高，反之释放出的自由基（O2-）浓度就低。当SOD活性降低时，歧化反应被抑制，自由基（O2-）浓度升高，从而抵制邻苯三酚的自氧化显色反应，其反应强度减弱，即反应中邻苯三酚自氧化的显色反应强度与SOD的活性呈正相关。样本中SOD活性（U/mL）=CS×（U/mL）式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值CS校准液中SOD的浓度与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：EDTA的中文名称是乙二胺四乙酸，是化学中一种良好的配合剂，它有六个配位原子，形成的配合物叫做螯合物，EDTA是螯合剂的代表性物质，一般是测定金属离子的含量，在生物应用中，用于排除大部分过度金属元素离子，如铁（III）、镍（II）、锰（II）等的干扰。在蛋白质工程及试验中可在不影响蛋白质功能的情况下去除干扰离子，因此本发明通过添加EDTA作为螯合剂，能够有效去除血清中部分金属离子的干扰，因此本发明对超氧化物歧化酶的检测的准确度比较高，另外由于邻苯三酚自氧化法显色反应较为明显，因此比较易于检测，操作比较方便。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。实施例1本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中试剂R1：HEPPS缓冲液75mmol/L叠氮钠0.5g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚2.0mmol/LEDTA10.0mmol/L其溶剂为纯化水。实施例2本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中试剂R1：HEPPS缓冲液140mmol/L叠氮钠0.7g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚0.5mmol/LEDTA20mmol/L其溶剂为纯化水。实施例3试剂盒的制备和使用方法1、按照下列组分含量配制好试剂：试剂R1：HEPPS缓冲液75mmol/L叠氮钠0.5g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚2.0mmol/LEDTA10.0mmol/L其溶剂为纯化水。2、全自动生化分析仪参数设置（a）检测温度：37℃；（b）检测波长：主波长420nm、副波长700nm；（c）反应时间：8min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；(d)反应方向：正反应。3、检测步骤（a）取200μl试剂R1与12μl待测样本混匀；（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；(d)根据SOD活性（U/mL）=CS×（U/mL）计算出样本中的超氧化物歧化酶的浓度。实施例4试剂盒的制备和使用方法1、按照下列组分含量配制好试剂：试剂R1：HEPPS缓冲液140mmol/L叠氮钠0.7g/L其溶剂为纯化水。试剂R2：邻苯三酚0.5mmol/LEDTA20mmol/L其溶剂为纯化水。2、全自动生化分析仪参数设置（a）检测温度：37℃；（b）检测波长：主波长420nm、副波长700nm；（c）反应时间：8min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；(d)反应方向：正反应。3、检测步骤（a）取200μl试剂R1与12μl待测样本混匀；（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；(d)根据SOD活性（U/mL）=CS×（U/mL）计算出样本中的超氧化物歧化酶的浓度。表1为实施例1所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的超氧化物歧化酶的浓度为196U/mL，测定结果见表1：表1由表1可知，本发明所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。表2为实施例1所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的超氧化物歧化酶的浓度为294U/mL，测定结果见表2：表2由表2可知，本发明所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。表3为实施例3所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：表3由表3可知本发明所制得的测定超氧化物歧化酶的试剂盒的精密度比较好，而且由表1可知，实施例3为最优的选择。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。