一种卡式蛋白芯片及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，特别是一种卡式蛋白芯片及其应用。

背景技术：

蛋白芯片技术作为近年来发展起来的一种多指标并行检测的新兴技术，具有高通量，高信息量的特点，在科研和临床诊断领域具有广泛的应用前景。但是，由于技术上、成本上的因素，限制了其实际应用，尤其是在临床诊断领域还没有得到应有的推广。目前，低成本、不用复杂昂贵设备、灵敏准确、能迅速作一次多元检测、操作简便适用于快速床边检测（POCT）的低密度蛋白芯片是蛋白芯片领域的一个重要的研究和发展方向。

近20年来，以侧向流免疫层析技术、渗滤法、斑点法为代表，研发生产用于疾病监测和诊断的免疫检测试剂已经广泛应用于快速床边检测（POCT），随着酶显色、胶体金、胶体硒、荧光微球、化学发光、量子点和其他更灵敏的标记技术的发展，快速检测领域标记技术呈现多样化趋势；由于这些技术的成熟应用及其在快速检测方面应用的优势以及实用性，它们也同样被应用于蛋白芯片的研究和开发。

目前，这类型以免疫层析技术、渗滤法、斑点法技术为基础，以POCT应用为目标的蛋白芯片产品在技术及应用上已经有了较大进展，但仍存在有以下缺点：（1）产品质量比较容易产生波动，不易进行质量控制；（2）同一个产品检测以单一目标为主，最多同时检测2-3个指标，多目标检测容易产生相互干扰；（3）所进行的实验基本只能进行定性，不能进行定量实验；（4）对于多目标体系，生产工艺及反应体系调整难度大。而传统的载玻片、硅片等作为芯片片基类型的蛋白芯片又存在操作复杂或生产要求高、成本高等因素在应用上受到很多限制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种卡式蛋白芯片及其应用，基于这种卡式结构和反应液体垂直方向由下向上的反向扩散导流层析设计，可以设计出多种检测模式和加样模式，满足对不同类型检测的需求，同时该设计具有快速检测的特性和可以同时进行多指标检测的特性，适用于床边多指标快速检测（POCT）。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种卡式蛋白芯片，包括了外壳壳体、加样口、结果判读窗口、功能垫、反应膜、多孔材料和吸收垫，外壳壳体表面开设有加样口和结果判读窗口，功能垫设置于加样口下方并与外壳壳体底部的多孔材料相连，反应膜下侧面与多孔材料相互贴合，结果判读窗口下方嵌入设置有吸收垫，吸收垫设置于反应膜两侧或环绕于四周周侧。

其中，功能垫由加样过滤垫和多层标记物垫中的一种或多种叠合组成，加样过滤垫为玻璃纤维，标记物垫为含有示踪标记物标记的抗原或抗体的玻璃纤维或无纺布。

优选的，加样过滤垫内包埋固定有干扰消除剂，干扰消除剂为抗红细胞抗体或抗IgM抗体，示踪标记物为荧光微球、量子点、胶体金或酶中的一种。

其中，反应膜为具有上下通孔的膜材料，多孔材料为玻璃纤维、无纺布或尼龙膜中的一种，吸收垫为纯棉绒浆滤纸、海绵或高分子吸水纸的一种。

优选的，纯棉绒浆滤纸克重为270g/m³，吸水量大于950g/m³。

优选的，功能垫中还包括辅助反应垫，辅助反应垫为包埋固定有金属盐、蛋白质或表面活性剂的玻璃纤维或无纺布。

本发明还公开了一种卡式蛋白芯片的应用，上述的卡式蛋白芯片，应用步骤如下：

a.在反应膜上按照预设的位置分别固定所需检测抗原或抗体，形成相应的检测阵列；

b.从加样口加入待测样本或待测样本和稀释液；

c.待测样本或待测样本和稀释液通过功能垫，并经多孔材料向上扩散层析，到达反应膜表面，在反应膜上与检测阵列发生抗原-抗体特异性结合；

d.等待抗原-抗体特异性结合反应结束后，通过肉眼或检测读数仪进行检测结果读取。

优选的，步骤d还包括：等待抗原-抗体特异性结合反应结束后，从结果判读窗口加入示踪标记反应液，待检测点形成标记免疫复合物后，通过肉眼或检测读数仪进行检测结果读取。

优选的，步骤d还包括：在进行检测结果读取之前，加入洗涤液洗去未结合在待测点上的反应物。

其中，示踪标记反应液为荧光微球、量子点、胶体金或酶标记物标记的抗原或抗体溶液。

本发明具有以下有益效果：

1.与传统的侧向流免疫层析蛋白芯片技术相比，该方法的主要特点是多孔性介质在蛋白芯片反应膜的正下方，反应膜下侧面与多孔材料相互贴合，反应膜上的蛋白芯片点样位点全部都在多孔性介质的贴合范围内，待测样本和反应试剂在多孔性介质中垂直方向由下向上的反向扩散导流层析，最终均一地到达反应膜，各反应点之间并不会产生相互干扰，并在检测点上进行免疫反应，降低了因侧向流免疫层析芯片前后反应区的不均一性,后反应区会受到前反应区干扰等因素引起的精密度变差以及漏诊概率，更好的符合多指标同时定性、定量准确检测的需求。

2.与传统的玻片作为载体的蛋白芯片技术相比，本发明可以克服载玻片法蛋白芯片操作相对复杂的缺点，操作更加简单，不需要仪器，最简化的只要一次加样就可以完成检测，更加适用于床边快速检测。

3.与渗滤法蛋白芯片相比，可以预先将蛋白探针标记物、抗干扰辅助成分、全血过滤组分等内容放置于反应结构体系内，简化使用者在操作过程中的操作步骤。

4.经过合理设计的卡式蛋白芯片对于标记物、添加物和底物的加样方式也可灵活选择，除了通过加样口加入样本外，通过对功能垫进行设计，增设过滤垫、多层标记物垫和辅助反应垫扩展检测类型，也可以通过结果判读窗口进行检测剂添加，有利于反应体系的调整，使反应体系能更容易避开不同反应物之间的干扰达到最优状态。

附图说明

图1为本发明卡式蛋白芯片的断面图。

图2为本发明卡式蛋白芯片的俯视图。

图3为本发明卡式蛋白芯片中功能垫6的局部示意图。

图4为本发明实施例3中使用蛋白芯片的断面图。

图5为本发明实施例4中使用蛋白芯片的断面图。

主要部件符号说明：

1：外壳壳体，2：吸收垫，3：反应膜，4：多孔材料，5：加样口，6：功能垫，7：结果判读窗口，61：加样过滤垫，62：标记物垫，63：辅助反应垫，621：上层标记物垫，622：下层标记物垫。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

如图1-3所示，本发明公开了一种卡式蛋白芯片，包括了外壳壳体1、吸收垫2、反应膜3、多孔材料4、加样口5、功能垫6和结果判读窗口7。

结构设计：

外壳壳体1表面开设有加样口5和结果判读窗口7，功能垫6设置于加样口5下方并与外壳壳体1底部的多孔材料4相连，结果判读窗口7下方嵌入设置有吸收垫2，吸收垫2设置于反应膜3的两侧或环绕于四周周侧，反应膜3下侧面与多孔材料4相互贴合。

功能垫6由加样过滤垫61、多层标记物垫62和辅助反应垫63中的一种或多种叠合组成，加样过滤垫61为选择性包埋固定有干扰消除剂的玻璃纤维，干扰消除剂包括了抗红细胞抗体、抗IgM抗体，标记物垫62为含有示踪标记物标记的抗原或抗体的玻璃纤维或无纺布，示踪标记物为荧光微球、量子点、胶体金或酶中的一种，辅助反应垫63为包埋固定有金属盐、蛋白质或表面活性剂的玻璃纤维或无纺布。

反应膜3为具有上下通孔的膜材料，多孔材料4为玻璃纤维、无纺布或尼龙膜中的一种，吸收垫2为纯棉绒浆滤纸、海绵或高分子吸水纸的一种。

其中，纯棉绒浆滤纸规格为克重270g/m³，吸水量大于950g/m³。

使用方法：

a.在反应膜3上按照预设的位置分别固定所需检测抗原或抗体，形成相应的的检测阵列；

b.从加样口5加入待测样本或待测样本和稀释液；

c.等待待测样本或待测样本和稀释液通过功能垫6，经多孔材料4向上反向扩散、导流层析与反应膜3上载有的检测阵列发生抗原-抗体特异性结合；

d.等待抗原-抗体特异性结合反应结束后，选择性从结果判读窗口7加入洗涤液；通过肉眼或检测读数仪进行检测结果读取。

实施例2

本发明公开了一种卡式蛋白芯片及其在血液筛查4项检测中的应用，检测对象为乙肝表面抗原HBsAg、人类免疫缺陷病毒抗体HIV-Ab、丙型肝炎抗体HCV-Ab、梅毒螺旋体抗体TP-Ab。

在该卡式蛋白芯片中，结构如实施例1所述，功能垫6包括了加样过滤垫61和标记物垫62，两者材质均为玻璃纤维，标记物垫62中包含有标记了荧光微球的表面抗体HBsAb1*、标记了荧光微球的重组人类免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag1*、标记了荧光微球的重组丙型肝炎抗原HCV-Ag1*、标记了荧光微球的重组梅毒螺旋体抗原TP-Ag1*四种胶体金结合物；多孔材料4为玻璃纤维，反应膜3为不带衬底的硝酸纤维素膜，以阵列形式固定乙肝表面抗体HBsAb2，重组人类免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag2、重组丙型肝炎抗原HCV-Ag2、重组梅毒螺旋体抗原TP-Ag2；

具体使用方法如下：

b.从加样口5加入120μL病人血清待测样本；

c.室温下反应20分钟，待测样本中的反应物质由功能垫6顺次通过加样过滤垫61和标记物垫62，血清样本中可能存在的反应物质HBsAg或HIV-Ab或HCV-Ab或TP-Ab与标记物垫62中相应的荧光微球标记的抗原或抗体形成荧光微球标记的第一步免疫复合物HBsAg～HBsAb1*或HIV-Ab～HIV-Ag1*或HCV-Ab～HCV-Ag1*或TP-Ab～TP-Ag1*，荧光微球标记的第一步免疫复合物随溶液经多孔材料4向上扩散，均匀地扩散、层析到达反应膜3表面，在反应膜3的相应检测点进行免疫反应，形成第二步固定化的荧光微球免疫复合物HBsAb2～HBsAg～HBsAb1*或HIV-Ag2～HIV-Ab～HIV-Ag1*或HCV-Ag2～HCV-Ab～HCV-Ag1*或TP-Ag2～TP-Ab～TP-Ag1*；

d.等待抗原-抗体特异性结合反应结束后，未结合的血清样本以及未结合的荧光微球结合物通过反应膜3的侧向层析,被吸收垫2吸收，通过肉眼判读结果，也可以采用配套的蛋白芯片荧光读数仪读取结果。

实施例3

如图4所示，为了提高检测的效果，本实施例是在实施例2的基础上进行了适当改进，在该卡式蛋白芯片中，结构如实施例1所述，功能垫6包括了加样过滤垫61和标记物垫62,其中标记物垫62包括了上层标记物垫621和下层标记物垫622，上层标记物垫621中包含有标记了荧光微球的表面抗体HBsAb1*、标记了荧光微球的重组人类免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag1*，下层标记物垫622中包含有标记了荧光微球的重组丙型肝炎抗原HCV-Ag1*、标记了荧光微球的重组梅毒螺旋体抗原TP-Ag1-Au两种荧光微球结合物，这样的组合结构，减少了4种结合物在试剂制备时的相互干扰，提高了试剂的稳定性和反应性。

在反应步骤d中，等待抗原-抗体特异性结合反应结束后，从结果判读窗口7加入100μL洗涤液，未结合的血清样本和荧光微球标记物以及洗涤液，通过反应膜3的侧向层析和涌动,被吸收垫2吸收；

通过肉眼判读结果，效果比实施例2的结果更优，信噪比更高，也可以采用配套的蛋白芯片胶体金读数仪读取结果。

实施例4

如图5所示，本发明公开了一种卡式蛋白芯片及其在双抗体夹心法检测4种心脑血管疾病相关的蛋白标志物中的应用，检测对象是D-Dimmer、BNP、S100B、LP-PLA2 4种心脑血管疾病相关标志物。

在该卡式蛋白芯片中，结构如实施例1所述，其中功能垫6只包括有加样过滤垫61，在加样过滤垫61中，包埋固定了抗人红细胞单抗，多孔材料4为玻璃纤维，反应膜3为尼龙膜，以阵列形式分别固定4种心脑血管疾病相关的蛋白标志物抗体。

具体使用方法如下：

b.从加样口5加入80μL病人全血待测样本，全血样本中的红细胞与加样过滤垫61中固定的抗人红细胞单抗形成红细胞免疫复合物，被截留在加样过滤垫61中，样本中的血清进入多孔材料4中，全血样本加样结束后，从加样口5再加入100μL 样本稀释液，样本稀释液与样本一同进入多孔材料4中；

c.室温下反应20分钟，待测样本中的心脑血管疾病相关的蛋白标志物由多孔材料4向上扩散、层析，均匀地扩散、层析到达反应膜3表面，在反应膜3的相应检测点固定的抗体进行免疫反应，形成心脑血管疾病相关的蛋白标志物免疫复合物；

d.从结果判读窗口7加入100μL标记有荧光微球的4项心脑血管疾病相关的蛋白标志物抗体溶液，在反应膜3上的相应抗体位形成荧光免疫复合物，再加入100μL磷酸盐缓冲液PBST进行洗涤，未结合的血清样本和荧光标记物以及洗涤液，通过反应膜3的侧向层析和涌动,被吸收垫2吸收，通过采用配套的蛋白芯片荧光读数仪读取结果。

实施例5

在实施例2或实施例4的基础上进行改进，将荧光微球替换为辣根过氧化物酶，最后步骤加入显色剂，也可以完成蛋白芯片的检测。

实施例6

在实施例2或实施例4的基础上进行改进，将荧光微球替换为胶体金，也可以完成蛋白芯片的检测。

实施例7

在实施例2的基础上进行改进，功能垫6除了包括加样过滤垫61和标记物垫62外，增加了辅助反应垫63，辅助反应垫63材质为玻璃纤维，包埋固定有NaCl以及Tween-20，适当增加反应体系的离子强度以及表面活性剂浓度，提高了蛋白芯片检测效果。

实施例8

本发明公开了一种卡式蛋白芯片及其在双抗体夹心法检测垂体腺瘤涉及激素的应用，检测对象泌乳素(PRL)，生长激素(GH)，促甲状腺素(TSH)，黄体生成素(LH)，卵泡促激素(FSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)。

在该卡式蛋白芯片中，结构如实施例1所述，其中功能垫6包括了加样过滤垫61和标记物垫62，其材质是玻璃纤维，其中标记物垫62包括了上层标记物垫621和下层标记物垫622，在加样过滤垫61中，包埋固定了抗人红细胞单抗，上层标记物垫621中包含了量子点标记的PRL抗体和量子点标记的GH抗体，下层标记物垫622中包含了量子点标记的TSH抗体和量子点标记的LH抗体，多孔材料4为无纺布，反应膜3为尼龙膜，以阵列形式分别固定6种垂体腺瘤涉及激素的抗体。

具体使用方法如下：

b.从加样口5加入80μL病人全血待测样本，全血样本中的红细胞与加样过滤垫61中固定的抗人红细胞单抗形成红细胞免疫复合物，被截留在加样过滤垫61中，样本中的血清顺次通过标记物垫62进入多孔材料4中，同时，上层标记物垫621和下层标记物垫622中的量子点标记的PRL抗体、量子点标记的GH抗体、量子点标记的TSH抗体和量子点标记的LH抗体随着血清也进入多孔材料4中，全血样本加样结束后，从加样口5再加入100μL 样本稀释液，样本稀释液与样本血清一同进入多孔材料4中；

c.室温下反应20分钟，待测样本中的PRL、GH、TSH、LH与量子点标记的相应抗体形成免疫复合物由多孔材料4向上扩散，均匀地向上扩散、层析到达反应膜3表面，在反应膜3的相应检测点与固定的抗体进行免疫反应，形成量子点标记的夹心免疫复合物，待测样本中的FSH、ACTH向上扩散、层析到达反应膜3表面，在反应膜3的相应检测点固定的抗体进行免疫反应，形成不带量子点的免疫复合物；

d.从结果判读窗口7加入100μL示踪标记反应液，示踪标记反应液中包含量子点标记的FSH抗体、量子点标记的ACTH抗体，在反应膜3上的相应抗体位形成量子点标记的夹心免疫复合物，再加入100μL磷酸盐缓冲液PBST进行洗涤，未结合的血清样本和量子点标记物以及洗涤液，通过反应膜3的侧向层析和涌动,被吸收垫2吸收；通过采用配套的蛋白芯片荧光读数仪读取结果。

在传统免疫检测中当PRL、GH、TSH、LH与FSH、ACTH同时检测时，往往会出现其中某些激素检测失真，经大量分析后发现，检测样本中PRL、GH、TSH、LH所需要进行的反应条件相近，而FSH、ACTH的最优反应条件与其他四项不同，进而产生相互干扰，本实施例通过分次添加标记物的方式可以减少多项检测中出现的相互干扰，提高检测的准确性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。