分子印迹水凝胶光子晶体微球的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种分子印迹光子晶体水凝胶的制备方法，该种微球可在较宽pH范围内应用于含顺式二羟基结构的生物分子的多元检测，如糖类、蛋白质的检测。

背景技术：

随着医疗技术的飞速发展，医学研究已进入分子层面的时代。传统的分子检测方法只能对单分子进行检测，而许多疾病通常与多种分子有关联，传统方法在此时显得效率低下，并且成本高昂，因此需要一种高通量的试验平台。高通量的实验平台则要求有高通量的分子载体来标识不同的分子，即所谓的编码过程。

以光子晶体微球为载体的液相芯片技术在生物分析以及蛋白质、基因、药物筛选中得到了越来越多的运用。相对于其他形式的载体，光子晶体微球具有显著的优势：第一，微球的比表面积大，能够增加有效反应表面积与体积之比，因此可以使表面的化学反应在更小的体积内进行；第二，采用微球作为载体可以利用一些其他辅助手段如搅拌、液体冲刷等实现一种介于固－液反应和液－液反应之间的反应体系，从而加快体系的反应速度；第三，微球依靠光子晶体固有的反射峰作为其编码方式，编码方式简单，稳定，并且便于解码。第四，随着微球表面功能化基团的改变，可以扩展微球的用途。例如将光子晶体和水凝胶结合起来作为载体进行编码成为高通量筛选以及组合化学等领域关注的热点。

分子印迹技术的原理是将目标分子与水凝胶共同混匀后聚合，之后洗脱除去印迹分子，利用留下的印迹来实现对印迹分子的检测，具有很高的特异性和灵敏度。近些年来，分子印迹相关的研究成果大幅增长，已成为材料学的一项热门技术。苯硼酸分子是一种可以与含顺式二羟基结构的分子，如葡萄糖、糖蛋白等在碱性条件下发生结合，而在酸性条件下解离。将苯硼酸分子作为功能单体加入水凝胶前聚体溶液中，苯硼酸可以与印迹分子的顺式二羟基结构结合，形成水凝胶后通过调节pH和多次清洗除去模板，便可以得到苯硼酸分子印迹水凝胶。苯硼酸分子印迹水凝胶可以增加与印迹分子之间的作用力，从而提升检测的特异性和灵敏度，并且实现载体使用的可重复性。

利用光子晶体微球为模板，制备反蛋白石结构水凝胶后，可以赋予微球新的优势：第一，水凝胶的比表面积大，因此可以使表面的化学反应更容易进行；第二，可以控制水凝胶收缩和舒张来控制其体积，以扩展其用途；第三，以水凝胶为载体可以保持蛋白的活性，提高检测的稳定性；第四，随着水凝胶表面功能化基团的改变，可以扩展水凝胶的用途，提升特异性和灵敏度。

技术实现要素：

为了解决现有非标记检测中检测选择性差，成本高等缺点，本发明提供一种制备用于多元检测的分子印迹光子晶体水凝胶微球的方法，其制备简单，成本低廉，大小均匀可控，可重复性好。

本发明提供的技术方案是：

一种分子印迹水凝胶光子晶体微球，其特征在于所述微球的反蛋白石水凝胶结构表面和内部有目的分子的印迹，该结构可以在不同pH条件下与目的分子结合或解离。所述分子印迹水凝胶光子晶体微球通过如下方法制备：以光子晶体微球为模板，将水凝胶前聚体溶液混匀后填充至光子晶体微球纳米粒子之间的孔隙内，当水凝胶凝胶化后，利用腐蚀剂腐蚀微球内的胶体纳米粒子，同时除去印迹分子模板，所得即为分子印迹水凝胶光子晶体微球。

优选的，所述水凝胶选自含硼酸基团水凝胶一种或两种以上的任意混合。

本发明提供了一种用于多元检测的分子印迹水凝胶光子晶体微球的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)制备光子晶体微球模板：单分散的胶体晶体纳米粒子加去离子水稀释形成胶体溶液，利用微流控装置使胶体溶液在连续相中被剪切成单分散的液滴，固化液滴模板，清洗，煅烧之后，即可获得光子晶体微球；

(2)将光子晶体微球表面进行亲水处理；

(3)将光子晶体微球投入含有印迹分子和苯硼酸的水凝胶聚合前体溶液中，当微球的颜色从白色变为鲜艳的彩色时固化水凝胶，然后将水凝胶浸泡在去离子水中，根据微球内外不同的膨胀程度从水凝胶中剥离光子晶体微球；

(4)将光子晶体微球投至调配好的腐蚀剂中，除去胶体粒子模板和印迹分子模板，并保存于PBS缓冲液中。

优选的，所述方法中使用的微流控装置为协流式或汇聚式微流控装置，微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、PDMS的一种或两种以上的任意组合。

优选的，所述方法中使用的胶体溶液选自二氧化硅胶体粒子溶液、二氧化钛胶体粒子溶液和聚苯乙烯类聚合物胶体粒子溶液中的一种或两种以上的任意混合，胶体粒子的粒径控制在50nm-1000nm之间。

优选的，所述方法中步骤(4)中去除液滴模板的腐蚀剂选自氢氟酸、NaOH或焦硫酸钾、四氢呋喃溶液的一种。

分子印迹水凝胶光子晶体微球是单纯的反结构水凝胶。该分子印迹水凝胶光子晶体微球具有生物学应用，如生物的多元分子检测等。制备的分子印迹水凝胶光子晶体微球,其大小均匀可控。分子印迹水凝胶光子晶体微球用于葡萄糖、蛋白质等生物分子的多元检测时，检测步骤如下：

(1)制备光子晶体微球模板：单分散的胶体晶体纳米粒子加去离子水稀释形成胶体溶液，利用微流控装置使胶体溶液在连续相中被剪切成单分散的液滴，固化液滴模板，清洗，煅烧之后，即可获得光子晶体微球；

(2)将光子晶体微球表面进行亲水处理；

(3)将光子晶体微球投入含有印迹分子和苯硼酸的水凝胶聚合前体溶液中，当微球的颜色从白色变为鲜艳的彩色时固化水凝胶，然后将水凝胶浸泡在去离子水中，根据微球内外不同的膨胀程度从水凝胶中剥离光子晶体微球；

(4)将光子晶体微球投至调配好的腐蚀剂中，除去胶体粒子模板和印迹分子模板，并保存于PBS缓冲液中。

(5)将制备好的水凝胶微球取出，吸除多余的液体后，加入到待检测样品溶液中混合，使之与样品溶液中的目的分子发生充分的特异性反应，洗涤后检测反应后的胶体晶体水凝胶微球的反射光谱，通过比较反应前后胶体晶体水凝胶微球的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶微球的反射光谱，确定待测物质的含量。

优选的，所述方法中使用的微流控装置为协流式或汇聚式微流控装置，微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、PDMS的一种或两种以上的任意组合。

优选的，所述方法中使用的胶体溶液选自二氧化硅胶体粒子溶液、二氧化钛胶体粒子溶液和聚苯乙烯类聚合物胶体粒子溶液中的一种或两种以上的任意混合，胶体粒子的粒径控制在50nm-1000nm之间。

优选的，所述方法中步骤(4)中去除液滴模板的腐蚀剂选自氢氟酸、NaOH或焦硫酸钾、四氢呋喃溶液的一种。

优选的，进行检测应用时，所述微球水凝胶的反射峰可用于生物分子编码。

优选的，进行检测应用时，所述微球的水凝胶印迹固定待测的生物分子，并引起水凝胶微球反射峰的变化。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

(1)本发明分子印迹水凝胶光子晶体微球利用光子晶体的反射峰位置作为编码，随着胶体粒子尺寸不同，反射峰的位置可以包含整个可见光区域，甚至可以是红外或紫外区域。

(2)本发明利用了分子印迹水凝胶技术，水凝胶的比表面积比较大，可以对痕量样品进行检测，满足适合高灵敏度载体的要求，能获得高的检测灵敏度；本发明利用分子印迹方法与待检测分子结合，很少发生交叉反应，因此具有很高的特异性；本发明利用苯硼酸作为功能单体，在pH为5.0～9.0左右对含顺式二羟基结构的分子的检测，并在酸性条件下可逆性解离，从而实现检测的可重复性；由于光子晶体的反射结构，载体表面对荧光标记的荧光的吸收降低，所以能够提高荧光的强度和检测反应的灵敏度。

(3)本发明分子印迹水凝胶光子晶体微球可以在较宽的pH范围内(5.0～9.0)对含顺式二羟基结构的生物分子如葡萄糖、蛋白质的多元检测。正常情况下，人体血液、唾液、眼泪、尿的pH范围是7.4，6.2-7.4，6.5-7.6和4.5-8.0。本发明几乎覆盖了血液，唾液，眼泪，尿的pH值范围，不需要对这些样品的pH进行调节，操作方便且降低了不稳定的组分降解的风险。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为苯硼酸分子印迹水凝胶光子晶体微球的制备示意图。

图2为光子晶体微球正结构表面(a)、内部(b)、灌胶后内部(c)、低浓度水凝胶(d)、高浓度水凝胶(e)和高浓度水凝胶截面(f)。

具体实施方式

实施例1以SiO₂光子晶体为模板的苯硼酸分子印迹水凝胶微球制备及其在辣根过氧化物酶检测中的应用:

1.有序光子晶体微球的制备：将单分散的SiO₂纳米粒子加去离子水调节浓度至20％-30％；利用自制的玻璃微流控装置使胶体溶液在流动相中剪切成单分散的液滴，将液滴模板置于烘箱75℃干燥固化，去除表面或内部的杂质后，置于马弗炉中800℃煅烧4h。

2.胶体晶体微球的亲水处理：煅烧后的胶体晶体微球首先被浸泡在体积比为7:3的浓硫酸和双氧水的混合液中12h以使微球表面羟基化，以超纯水反复清洗胶体晶体微球，并在0.02MPa的氮气气流下吹干。

3.苯硼酸水凝胶聚合前体溶液的配制：称取10mg辣根过氧化物酶，并将辣根过氧化物酶用0.1M pH7.0的PBS缓冲液配制成100μL的酶溶液；取2μL光引发剂、1mg苯硼酸、40μL聚乙二醇200和40μL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液混匀，然后加入20μL的酶溶液、50μL聚乙二醇二丙烯酸酯700和48μL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液，室温下混匀孵育10分钟，所得即为苯硼酸水凝胶聚合前体溶液。

4.苯硼酸水凝胶填充：将胶体晶体微球浸泡苯硼酸水凝胶聚合前体溶液中，至微球从白色变为彩色，用强紫外光照射聚合5～10s。然后将苯硼酸水凝胶浸泡至去离子水溶液中，由于微球内外不同的膨胀系数，在微球表面会形成缝隙，很容易就可以将微球从水凝胶中剥离出来。

5.模板去除：将完全剥离后的填充有苯硼酸的SiO₂微球浸泡至HF溶液中，HF溶液可从外向内均匀腐蚀SiO₂粒子，最终形成苯硼酸水凝胶微球；由于是酸性环境，苯硼酸分子与印迹分子解离。

6.印记分子的去除：用0.1M pH7.0的PBS缓冲液反复清洗三次微球来除去印迹的分子，最终获得分子印迹水凝胶光子晶体微球。

7.辣根过氧化物酶标准曲线的绘制：将所得的分子印迹水凝胶光子晶体微球测定反射峰后，将其浸入100μL不同浓度的辣根过氧化物酶溶液中，充分反应30分钟后再次测量反射峰并计算反射峰变化，根据所得数据绘制辣根过氧化物酶浓度标准曲线。

8.对待测液中辣根过氧化物酶的检测：将所得的分子印迹水凝胶光子晶体微球测定反射峰后，将其浸入100μL待测溶液中，充分反应30分钟后再次测量反射峰并计算反射峰变化，根据所得数据与辣根过氧化物酶标准曲线进行对比从而得到待测液中辣根过氧化物酶的浓度。

实施例2以SiO₂光子晶体为模板的苯硼酸分子印迹水凝胶微球制备及其在核糖核酸酶B检测中的应用:

1.有序光子晶体微球的制备：将单分散的SiO₂纳米粒子加去离子水调节浓度至20％-30％；利用自制的玻璃微流控装置使胶体溶液在流动相中剪切成单分散的液滴，将液滴模板置于烘箱75℃干燥固化，去除表面或内部的杂质后，置于马弗炉中800℃煅烧4h。

2.胶体晶体微球的亲水处理：煅烧后的胶体晶体微球首先被浸泡在体积比为7:3的浓硫酸和双氧水的混合液中12h以使微球表面羟基化，以超纯水反复清洗胶体晶体微球，并在0.02MPa的氮气气流下吹干。

3.苯硼酸水凝胶聚合前体溶液的配制：称取10mg核糖核酸酶B，并将核糖核酸酶B用0.1M pH7.0的PBS缓冲液配制成100μL的酶溶液；取2μL光引发剂、1mg苯硼酸、40μL聚乙二醇200和40μL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液混匀，然后加入20μL的酶溶液、50μL聚乙二醇二丙烯酸酯700和48μL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液，室温下混匀孵育10分钟，所得即为苯硼酸水凝胶聚合前体溶液。

4.苯硼酸水凝胶填充：将胶体晶体微球浸泡苯硼酸水凝胶聚合前体溶液中，至微球从白色变为彩色，用强紫外光照射聚合5～10s。然后将苯硼酸水凝胶浸泡至去离子水溶液中，由于微球内外不同的膨胀系数，在微球表面会形成缝隙，很容易就可以将微球从水凝胶中剥离出来。

5.模板去除：将完全剥离后的填充有苯硼酸的SiO₂微球浸泡至HF溶液中，HF溶液可从外向内均匀腐蚀SiO₂粒子，最终形成苯硼酸水凝胶微球；由于是酸性环境，苯硼酸分子与印迹分子解离。

6.印记分子的去除：用0.1M pH7.0的PBS缓冲液反复清洗三次微球来除去印迹的分子，最终获得分子印迹水凝胶光子晶体微球。

7.核糖核酸酶B标准曲线的绘制：将所得的分子印迹水凝胶光子晶体微球测定反射峰后，将其浸入100μL不同浓度的核糖核酸酶B溶液中，充分反应30分钟后再次测量反射峰并计算反射峰变化，根据所得数据绘制核糖核酸酶B的浓度标准曲线。

8.对待测液中核糖核酸酶B的检测：将所得的分子印迹水凝胶光子晶体微球测定反射峰后，将其浸入100μL待测溶液中，充分反应30分钟后再次测量反射峰并计算反射峰变化，根据所得数据与核糖核酸酶B标准曲线进行对比从而得到待测液中核糖核酸酶B的浓度。

实施例3以SiO₂光子晶体为模板的苯硼酸分子印迹水凝胶微球制备及其在转铁蛋白酶检测中的应用:

1.有序光子晶体微球的制备：将单分散的SiO₂纳米粒子加去离子水调节浓度至20％-30％；利用自制的玻璃微流控装置使胶体溶液在流动相中剪切成单分散的液滴，将液滴模板置于烘箱75℃干燥固化，去除表面或内部的杂质后，置于马弗炉中800℃煅烧4h。

2.胶体晶体微球的亲水处理：煅烧后的胶体晶体微球首先被浸泡在体积比为7:3的浓硫酸和双氧水的混合液中12h以使微球表面羟基化，以超纯水反复清洗胶体晶体微球，并在0.02MPa的氮气气流下吹干。

3.苯硼酸水凝胶聚合前体溶液的配制：称取10mg转铁蛋白酶，并将转铁蛋白酶用0.1M pH7.0的PBS缓冲液配制成100μL的酶溶液；取2μL光引发剂、1mg苯硼酸、40μL聚乙二醇200和40μL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液混匀，然后加入20μL的酶溶液、50μL聚乙二醇二丙烯酸酯700和48μL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液，室温下混匀孵育10分钟，所得即为苯硼酸水凝胶聚合前体溶液。

4.苯硼酸水凝胶填充：将胶体晶体微球浸泡苯硼酸水凝胶聚合前体溶液中，至微球从白色变为彩色，用强紫外光照射聚合5～10s。然后将苯硼酸水凝胶浸泡至去离子水溶液中，由于微球内外不同的膨胀系数，在微球表面会形成缝隙，很容易就可以将微球从水凝胶中剥离出来。

5.模板去除：将完全剥离后的填充有苯硼酸的SiO₂微球浸泡至HF溶液中，HF溶液可从外向内均匀腐蚀SiO₂粒子，最终形成苯硼酸水凝胶微球；由于是酸性环境，苯硼酸分子与印迹分子解离。

6.印记分子的去除：用0.1M pH7.0的PBS缓冲液反复清洗三次微球来除去印迹的分子，最终获得分子印迹水凝胶光子晶体微球。

7.转铁蛋白酶标准曲线的绘制：将所得的分子印迹水凝胶光子晶体微球测定反射峰后，将其浸入100μL不同浓度的转铁蛋白酶溶液中，充分反应30分钟后再次测量反射峰并计算反射峰变化，根据所得数据绘制转铁蛋白酶浓度标准曲线。

8.对待测液中转铁蛋白酶的检测：将所得的分子印迹水凝胶光子晶体微球测定反射峰后，将其浸入100μL待测溶液中，充分反应30分钟后再次测量反射峰并计算反射峰变化，根据所得数据与转铁蛋白酶标准曲线进行对比从而得到待测液中转铁蛋白酶的浓度。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。