一种抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭方法与流程

本发明涉及生物技术领域中一种抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭方法。

背景技术：

在经典的免疫分析方法中，抗原抗体之间的亲和识别构成了传感的基础。亲和作用是特定生物分子结构下配体和受体间一系列非共价力(亲疏水作用、静电作用、氢键等)的总称，多重弱力的综合作用保证了亲和双方的稳定结合。然而，在复杂体系中存在的非目标物质可能在不同程度上对亲和配体和受体产生吸附，称为“非特异性吸附”。在实际实验操作与相关器件设计中，通常需加入封闭剂(blocking agent)与传感界面的活性位点结合，以降低非特异性吸附，同时不干扰体系中目标亲和反应的正常进行。在传统免疫亲和反应中，通常由廉价易得的蛋白质担任封闭剂，如牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)等。

除蛋白参与的亲和反应外，近二十余年来，以功能核酸作为新型生物识别元件的传感分析方法也取得了迅猛的发展。功能核酸是具有亲和识别、催化等特定功能的寡聚核苷酸片段，以核酸适配体(aptamer)与DNA酶(DNAzyme)两种核酸材料为代表。目前已有百余种功能核酸被报道，其识别对象涵盖金属离子、生物毒素、细胞代谢物、大分子蛋白等上百种物质，其应用领域集中于生物传感及活细胞诊疗等方面。

在构建基于功能核酸的传感界面时，同样需要规避核酸分子对传感界面的“非特异性吸附”，针对不同的传感体系进行封闭处理。在免疫传感中应用广泛的蛋白封闭材料在封闭核酸界面时有所不足：1)在金属离子参与重要反应或作为靶标物的体系中，蛋白封闭层的存在可能会干扰传感过程的进行；2)蛋白是由氨基酸缩合所形成的聚合物大分子，表面电荷分布不均匀，对于柔性、丝状的核酸材料可能存在较强的局部吸附位点(如碱性氨基酸对负电性核酸链的静电吸附)。因此，蛋白材料并非抑制核酸分子非特异性吸附的最佳选择。

2016年，加拿大滑铁卢纳米研究中心的Juewen Liu课题组在一种基于均相溶液的石墨烯-核酸复合物传感体系中系统地探究了十种表面封闭材料对核酸分子非特异性吸附的抑制效果；该课题组所涉及的主要封闭材料包括高分子聚合物、表面活性剂以及核酸短链(以A₁₅为代表)，其研究表明，静电作用在抑制核酸的非特异性吸附过程中起到重要的作用；此外，核酸短链是一种具有潜力的封闭材料，核酸链长度越长，与传感表面的封闭结合越强。然而，该课题组的研究系将传感探针核酸通过π-π堆积作用吸附固载于石墨烯表面，存在传感探针核酸与封闭核酸竞争石墨烯表面位点的可能性；此外，石墨烯-核酸系统在体相溶液中进行传感，器件难以重复使用。事实上，相较于均相溶液中的传感探针设计，基于光纤、光波导芯片、电极等界面结构的生物传感器具有探针固载稳定、集成化高、界面可反复利用(单次检测成本低)、监测可实时进行等优势，符合严格意义上对生物传感器的要求。其中，探针固载稳定是指基于传感界面借助共价或亲和方式固载探针，较之吸附固载策略更为强健耐用。在现有的基于界面的核酸传感器中，非特异性吸附情况仍然普遍存在。目前尚无普适的优质封闭剂见诸报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附，来实现传感界面的封闭。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种抑制核酸分子对传感器界面非特异性吸附的封闭方法。

本发明所提供的抑制核酸分子对传感器界面非特异性吸附的封闭方法，包括用鲑鱼精DNA(SSDNA)处理传感器，实现传感器的封闭。

上述封闭方法中，所述鲑鱼精DNA为变性的鲑鱼精DNA，如经超声处理变性的鲑鱼精DNA。所述鲑鱼精DNA可采用酚氯仿抽提得到。所述鲑鱼精DNA具体可为索莱宝(solarbio)的货号为H1060的SSDNA。所述变性的鲑鱼精DNA是指长链断裂、形成多短链片段的鲑鱼精DNA。

上述封闭方法中，所述用鲑鱼精DNA处理传感器可包括用鲑鱼精DNA溶液处理所述传感器；所述鲑鱼精DNA溶液中的溶质为鲑鱼精DNA。所述鲑鱼精DNA溶液由所述溶质与溶剂组成，所述溶剂只要满足所述封闭要求即可。

上述封闭方法中，所述鲑鱼精DNA溶液的溶剂可为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度为0.1M磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、0.15M氯化钠，pH为7.4。其中0.1M磷酸氢二钠与磷酸二氢钠表示在PBS缓冲液中磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的总浓度为0.1M。

上述封闭方法中，所述鲑鱼精DNA在所述鲑鱼精DNA溶液中的浓度为0.01mg/mL-10mg/mL。所述鲑鱼精DNA在所述鲑鱼精DNA溶液中的浓度具体可为0.01mg/mL-0.1mg/mL，如0.05mg/mL。

上述封闭方法中，所述用鲑鱼精DNA处理传感器或所述用鲑鱼精DNA溶液处理所述传感器的时间均可为2-5小时，如2小时。

上述封闭方法中，所述用鲑鱼精DNA处理传感器或所述用鲑鱼精DNA溶液处理所述传感器均可在30-37℃下进行。

上述封闭方法中，所述传感器可为生物传感器或光纤传感器。所述生物传感器是指利用生物材料做识别元件的传感器，常见的生物材料包括：抗体、功能蛋白、全细胞、核酸等。

上述封闭方法中，所述传感器具体可为下述a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)倏逝波光纤传感器；

a2)核酸传感器；

a3)光纤生物传感器；

a4)倏逝波光纤生物传感器。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鲑鱼精DNA在抑制核酸分子对感器界面非特异性吸附中的应用。

上述应用中，所述传感器可为生物传感器或光纤传感器。所述生物传感器是指利用生物材料做识别元件的传感器，常见的生物材料包括：抗体、功能蛋白、全细胞、核酸等。

上述应用中，所述传感器具体可为下述a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)倏逝波光纤传感器；

a2)核酸传感器；

a3)光纤生物传感器；

a4)倏逝波光纤生物传感器。

本发明中，所述光纤具体可为600μM芯径的光纤。该600μM芯径的光纤具体可为南京春辉科技实业有限公司产品。

本发明以鲑鱼精DNA为封闭剂，在37℃条件下对修饰后的传感界面进行封闭。封闭后的界面可以在流动相存在的情况下保持稳定，且有效抑制了非目标核酸的非特异性吸附。具体而言(图4)，在不封闭的情况下，传感表面呈现出较多活性位点，易于结合液相中的非目标核酸，形成较为强烈的非特异性吸附；在采用鲑鱼精DNA封闭的体系中，不仅多数活性位点被鲑鱼精DNA封闭，更存在界面与游离核酸之间的静电斥力(鲑鱼精DNA和液相中游离核酸均呈现负电性，同性相斥)，因此核酸对传感界面的非特异性吸附被有效抑制。采用SSDNA封闭策略的传感界面上核酸分子的特异性结合与非特异性吸附的信号比分别为无封闭、传统的BSA封闭以及单纯的A寡聚物封闭策略的40.20、6.93和4.23倍，采用SSDNA封闭策略对传感界面进行封闭的效果显著优于无封闭、传统的BSA封闭以及单纯的A寡聚物封闭策略；并且采用SSDNA进行封闭具有经济、简便、快速的优点。本发明适用于所有依赖于固液界面(如本发明中光纤-待测液就是一种固液界面)进行检测的生物传感器。

附图说明

图1是本发明对比特异性吸附与非特异性吸附信号的方法。

图2为合成BSA-DTB复合物的反应过程。

图3为BSA-DTB复合物修饰光纤的反应过程。

图4是本发明SSDNA抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭方法的示意图。

图5是本发明降低非特异性吸附效果的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的PBS缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为0.1M0.1M磷酸氢二钠与磷酸二氢钠(即二者在PBS缓冲液中的总浓度为0.1M)，0.15M氯化钠，pH 7.4。

下述实施例中的洗脱液为SDS水溶液，其中SDS的质量百分比为0.05％，用盐酸调整pH为1.9；SDS为amresco产品，货号为M107。

实施例1、利用SSDNA对传感界面进行封闭

评价非特异性吸附程度的一个重要指标为特异性结合与非特异性吸附的信号比。本实施例中利用链霉亲和素(Streptavidin，STV)与脱硫生物素(Desthiobiotin，DTB)的亲和识别构建特异性结合识别对。如图1所示，首先构建脱硫生物素修饰的光纤，该光纤可以特异性结合含链霉亲和素的核酸缀合物探针(STV-DNA-Cy5.5)，获取特异性结合信号；同时，利用游离链霉亲和素与游离的核酸设置对照组，考察非特异性结合信号。对比特异性结合信号与非特异性结合信号的比值，即可评价系统的非特异性吸附程度。

一、合成BSA-DTB复合物

考虑到倏逝波光纤系统的特性，在光纤表面构建结构层以屏蔽流动相中荧光分子可能造成的荧光干扰，本发明以经济易得的牛血清蛋白为结构材料，作为脱硫生物素的载体，制备牛血清蛋白-脱硫生物素复合物(BSA-DTB复合物)。通过一系列交联剂将BSA-DTB复合物修饰在光纤表面。其中，合成BSA-DTB复合物的方法如图2所示，图2中BSA-DTB表示BSA-DTB复合物：利用BSA表面氨基与脱硫生物素衍生物——NHS脱硫生物素(NHS-DTB，Thermo，货号：16129)进行缀合反应。具体制备方法如下：

向PBS缓冲液中加入BSA得到BSA浓度为4mg/mL的BSA溶液，向BSA溶液中加入放至室温的NHS-DTB，使NHS-DTB与BSA的摩尔比为10:1，于室温下反应1h；将反应后的混合液(主要包含BSA-DTB目标产物以及未反应的NHS-DTB小分子)分批次加入Amicon-10K超滤管中，进行初步离心纯化(12000rpm,离心10min)；初步纯化后，再向内管中加入200μL PBS缓冲液，于12000rpm离心10min，重复8次后收集内管液体，获得纯化的BSA-DTB复合物，于4℃保存。

二、制作脱硫生物素修饰的光纤

用Piraha溶液(由浓H₂SO₄与市售的30％(质量百分比浓度)H₂O₂组成，浓H₂SO₄与30％H₂O₂的体积比为3:1，其中，浓H₂SO₄为北京化工厂生产的98％的浓硫酸)于120℃下浸泡光导纤维(简称光纤，600μM芯径(南京春辉科技实业有限公司))，该光纤在实验中在通入激光的条件下表面可形成倏逝场)一小时，然后用超纯水充分洗涤光纤至洗液中性(pH约为7)，并用氮气吹干光纤，放于70℃烘箱中过夜；次日用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MTS)的体积百分比浓度为2％的MTS溶液(该MTS溶液的溶剂为无水甲苯)在室温下浸泡光纤两小时，之后用无水甲苯清洗数次；然后将光纤放入4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)的浓度为1mg/mL的GMBS溶液(该GMBS溶液的溶剂为乙醇)于室温反应1h，将反应后的光纤用乙醇冲洗三次，再用高纯水冲洗干净，得到待用光纤。

利用紫外分光光度计对进行定量，将步骤一得到的BSA-DTB复合物加至PBS缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mL的BSA-DTB溶液(该BSA-DTB溶液的浓度是以蛋白(即BSA)来计的)；将待用光纤放入BSA-DTB溶液中，确保BSA-DTB溶液中的BSA-DTB相对于光纤是过量的，于4℃过夜反应(12小时)。次日用去离子水清洗反应后的光纤后于4℃保存(整体修饰过程如图3所示)，得到BSA-DTB修饰的光纤。

三、检测SSDNA封闭效果

一)SSDNA的制备：

将SSDNA(solarbio产品，货号为H1060)用PBS缓冲液溶解，得到SSDNA浓度为0.05mg/mL的SSDNA溶液。其中，Solarbio的货号为H1060的SSDNA为从鲑鱼精子中利用酚氯仿抽提并经超声处理变性的鲑鱼精DNA，该变性的鲑鱼精DNA长链断裂、形成多短链片段。

二)SSDNA封闭光纤

本步骤中选用biotin-A₂₀-Cy5.5(BA20)为实验组目标核酸，以A₂₀-Cy5.5(A20)为空白对照组核酸，实验重复三次。其中，BA20的5′端到3′端的序列如序列表中序列1所示，BA20序列的5′端由生物素标记，3′端由Cy5.5标记；A20的5′端到3′端的序列如序列表中序列1所示，BA20序列的3′端由Cy5.5标记。

将步骤二得到的BSA-DTB修饰的光纤分为5组，将这五组分别命名为对照组、None组、BSA组、A20组和SSDNA组。

1、将SSDNA组按照如下方式进行处理：

在37℃用0.05mg/mL的SSDNA溶液封闭SSDNA组的BSA-DTB修饰的光纤两小时，得到SSDNA封闭的光纤。

将biotin-A₂₀-Cy5.5(BA20)与同摩尔浓度的链霉亲和素(STV)在室温下于PBS缓冲液中反应20分钟，得到反应液BA20-STV，使BA20上的生物素(biotin)与STV发生亲和识别，同时STV仍保有多余亲和位点可以和光纤表面的脱硫生物素分子结合。将A20与同摩尔浓度的STV在室温下于PBS缓冲液中反应20分钟，得到反应液A20-STV。

将反应液BA20-STV通入倏逝波光纤传感平台(倏逝波光纤传感平台为中国专利申请号为200610089497.4的全光纤倏逝波生物传感器)。在光纤检测过程中，首先用PBS缓冲液冲洗SSDNA封闭的光纤直至基线平稳；基线平稳后，将反应液BA20-STV为待测液，开启蠕动泵进样15s；之后停止蠕动泵，使待测液在反应池内反应90s；再次开启蠕动泵，通入洗脱液；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳，同时停止采样，保存数据(该数据为特异性结合信号与非特异性信号的混合信号，将其命名为S_a+b/SSDNA)。

按照上述方法，将BA20-STV替换为A20-STV，作为对照，其他步骤均不变，得到非特异性信号，将其命名为S_b/SSDNA。特异性结合信号与非特异性信号的比值＝(S_a+b/SSDNA-S_b/SSDNA)÷S_b/SSDNA。

2、将A20组按照如下方式进行处理：

将A寡聚物(序列如序列表中序列1所示)用PBS缓冲液溶解，得到A寡聚物浓度为0.05mg/mL的A寡聚物溶液。在37℃用0.05mg/mL的A寡聚物溶液封闭A20组的BSA-DTB修饰的光纤两小时，得到A寡聚物封闭的光纤。

将步骤1的反应液BA20-STV通入倏逝波光纤传感平台。在光纤检测过程中，首先用PBS缓冲液冲洗A寡聚物封闭的光纤直至基线平稳；基线平稳后，将反应液BA20-STV为待测液，开启蠕动泵进样15s；之后停止蠕动泵，使待测液在反应池内反应90s；再次开启蠕动泵，通入洗脱液；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳，同时停止采样，保存数据(该数据为特异性结合信号与非特异性信号的混合信号，将其命名为S_a+b/A20)。

按照上述方法，将BA20-STV替换为步骤1的A20-STV，作为对照，其他步骤均不变，得到非特异性信号，将其命名为S_b/A20。特异性结合信号与非特异性信号的比值＝(S_a+b/A20-S_b/A20)÷S_b/A20。

3、将BSA组按照如下方式进行处理：

将BSA用PBS缓冲液溶解，得到BSA浓度为0.05mg/mL的BSA溶液。在37℃用0.05mg/mL的BSA溶液封闭BSA组的BSA-DTB修饰的光纤两小时，得到BSA封闭的光纤。

将步骤1的反应液BA20-STV通入倏逝波光纤传感平台。在光纤检测过程中，首先用PBS缓冲液冲洗BSA封闭的光纤直至基线平稳；基线平稳后，将反应液BA20-STV为待测液，开启蠕动泵进样15s；之后停止蠕动泵，使待测液在反应池内反应90s；再次开启蠕动泵，通入洗脱液；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳，同时停止采样，保存数据(该数据为特异性结合信号与非特异性信号的混合信号，将其命名为S_a+b/BSA)。

按照上述方法，将BA20-STV替换为步骤1的A20-STV，作为对照，其他步骤均不变，得到非特异性信号，将其命名为S_b/BSA。特异性结合信号与非特异性信号的比值＝(S_a+b/BSA-S_b/BSA)÷S_b/BSA。

4、将None组按照如下方式进行处理：

将步骤2的反应液BA20-STV通入倏逝波光纤传感平台。在光纤检测过程中，首先用PBS缓冲液冲洗None组的BSA-DTB修饰的光纤直至基线平稳；基线平稳后，将反应液BA20-STV为待测液，开启蠕动泵进样15s；之后停止蠕动泵，使待测液在反应池内反应90s；再次开启蠕动泵，通入洗脱液；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳，同时停止采样，保存数据(该数据为特异性结合信号与非特异性信号的混合信号，将其命名为S_a+b/None)。

按照上述方法，将BA20-STV替换为步骤1的A20-STV，作为对照，其他步骤均不变，得到非特异性信号，将其命名为S_b/None。特异性结合信号与非特异性信号的比值＝(S_a+b/None-S_b/None)÷S_b/None。

SSDNA抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭过程如图4所示，上述实验结果如图5所示。结果显示，None组、BSA组、A20组和SSDNA组的光纤上核酸分子的特异性结合与非特异性吸附的信号比分别为1.0、5.8、9.5和40.2，采用SSDNA封闭策略可有效将光纤上核酸分子的特异性结合与非特异性吸附的信号比比提升到40.20倍，效果显著优于无封闭(None组)、传统的BSA封闭(BSA组)以及单纯的A寡聚物封闭(A20组)策略，采用SSDNA封闭策略的光纤上核酸分子的特异性结合与非特异性吸附的信号比分别为无封闭、传统的BSA封闭以及单纯的A寡聚物封闭策略的40.20、6.93和4.23倍。