一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的制作方法

本发明涉及动物传染性疾病检测器械技术领域，具体是涉及一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。

背景技术：

根据国家有关实验室统计数据，2012年商品肉鸡感疫病染率最高的依然是H9N2。如果将H9N2与H5加起来，总的感染率是82.21％。这说明每只鸡死亡的原因，有82.21％来源于禽流感。而由其他疾病导致的只占17.79％。在商品肉鸡、肉杂鸡、青年鸡群中，根据国家有关机构资料证明，H9N2流感病毒(AIV)隐性感染率1％。单独感染H9N2之后并没有固定的临床表现症状。通过病毒接种实验，看不到H9N2的任何病变和症状，曾采取肌注等多种方式攻毒后，未发现H9N2有任何的临床表现症状。这说明H9N2并不单独感染，也不致病，只有继发或并发了其他的疾病之后才会表现出一些临床症状。因此，在防控H9N2型禽流感时应将治疗与它一起作怪的疾病同步进行。

H9N2流感在冬春季节发病时一般常见的发病形式是流感继发气囊炎形式，病变上主要表现部分鸡肿头肿脸、拉绿色粪便、有呼吸道症状、眼睛流泪、缩头闭眼等。病变主要表现在胰脏边沿出血、胸腺肿胀出血、气管出血、气管下部有出血环、纤维素性肺炎等。如果继发感染后，主要表现腹腔、前胸气囊内出现泡沫等浆液性渗出物，2天后肺脏会出现典型的纤维素性肺炎。出现水肿充血期(水肿充血期)、发红出血(红色肝变期)、肺脏浅灰色肿胀(灰色肝变期)、逐步出血纤维素样坏死(纤维素样肝变期)，部分地区出血结核性肺炎等病变。在中后期各个气囊、腹腔内都会同时出现严重的干酪样渗出物；部分有纤维素样渗出物。就构成所谓的“气囊炎病”或“流感气囊炎病”。

目前对于H9N2亚型禽流感病毒的预防首先是增强鸡的抵抗力，可以选用增强免疫的中药方剂进行保健。一般免疫都是选在前三周进行，这三周至少要进行1-2个疗程的保健，如果不保健的话，鸡就极有可能发病，其次针对不同的鸡群合理应用抗生素；此外，在免疫时须再次增强抵抗力，同时对H9N2亚型禽流感病毒的检测也是至关重要，特别对于基层的动物疫控工作者来说，快速的检测出病毒对于及时的防止感染有很关键的作用。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种灵敏度高、使用方便的快速检测H9N2亚 型禽流感病毒的试剂盒。

本发明的技术方案为：一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述的盒体包括样品采集区和结果显示区；所述的检测卡镶嵌在盒体中，包括底板、吸水滤纸、显色垫和样品垫，吸水滤纸、显色垫和样品垫依次粘结在底板上；所述的样品垫包括保护垫和胶体金层，保护垫卡在胶体金层上方，所述的胶体金层是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫包括检测区和质控区，所述检测区包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区包被有兔抗鼠IgG抗体。

进一步的，所述的底板为合成树脂材料制得，所述的合成树脂为高分子化合物，是由低分子原料氯乙烯通过聚合反应结合成大分子悬浮聚合生产的，悬浮聚合将单体在机械搅拌或振荡和分散剂的作用下，单体分散成液滴，通常悬浮于水中进行的聚合过程，这种方法物料粘度低，容易传热和控制，聚合后只需经过简单的分离、洗涤、干燥等工序，即得树脂产品，产品纯净、均匀；所述的检测区包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体而形成的检测线，所述的质控区包被有兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述的检测线采用抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体浓度为0.3-0.5mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用兔抗鼠IgG抗体浓度为1.0-1.2mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为医用皂化醋酸纤维素膜，所述的皂化醋酯纤维是用纤维素为原料，经化学法转化成醋酸纤维素酯制成的化学纤维，耐光性较好，伸缩率低，不受待检成分中化学物质的影响。

一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法为：

步骤一、胶体金标记抗原溶液制备：

a.将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至100℃，再按3-5％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，反应10-20min，胶体金溶液由完全变成紫色，继续保持100℃加热，胶体金溶液变成紫红色后，停止加热并冷却至25℃，使用碳酸钾溶液调节pH至8.0-9.0，得到胶体金溶液，备用；

b.用制备好的PBS缓冲液将H9N2亚型禽流感病毒抗原稀释至蛋白含量为0.5-0.8mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液成分含量为8％BSA，3％蔗糖，0.8％NaCl和0.03％NaN3，再将稀释液在5-8℃条件下2400-3000r/min离心10-20min， 去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，在5-8℃条件下2400-3000r/min离心30-60min，静置8-12h后，即得到胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原；

步骤二、样品垫制备：

a.将聚乙二醇200 12-15g、聚乙烯吡咯烷酮15-20g、牛血清白蛋白10-15g、屈立通X-1000 1-1.5ml、吐温20 5-8ml混合后用5mM-10mM磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH值9.3-9.5得到处理液，将所述的保护垫浸泡于处理液中20-30min，取出于37℃恒温烘干后封存，备用；

b.将胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原溶液均匀喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，制得胶体金层，再将胶体金层与保护垫粘结，即制得所述的样品垫。

步骤三、显色垫制备：将抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体稀释成浓度为0.3-0.5mg/mL的包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上得到检测线；将兔抗鼠IgG抗体稀释成浓度为1.0-1.2mg/mL包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃恒温干燥3-5h，封存，即得到所述的显色垫；

步骤四、试剂盒制备：给底板上粘结显色垫，然后在显色垫的上方粘结吸水滤纸，显色垫与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在显色垫的下方粘结样品垫，显色垫和样品垫之间相互交叠0.2mm，按5-8mm的宽度，25-30mm的长度进行切割裁剪，制得检测卡，将检测卡放在塑料壳体中，样品垫与样品采集区对准，显色垫与结果显示区对准，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。

本发明试剂盒的使用方法：将待检测鸡血液30μl滴于试剂盒样品采集区的样品垫上，5-10min之内观察色变情况，鸡血液中的红细胞凝集与特异性免疫血清所抑制，若待检样品中含有H9N2亚型禽流感病毒，则与样品垫中的胶体金标记的病毒特异性抗原结合，通过免疫层析作用与硝酸纤维素膜上的抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体结合后，会形成肉眼可见的一条红色检测线，未结合完的胶体金标记的病毒特异性抗原继续层析与和兔抗鼠IgG抗体结合后亦形成肉眼可见的第二条红色质控线；若待检样品中不含H9N2亚型禽流感病毒抗原，则仅出现一条红色质控线；若红色质控线未出现，则该检测试剂盒失效。

本发明的试剂盒的有益效果体现在：该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作检测试剂盒，利用胶体金免疫层析的原理，能在常温下5-10min内得到检测结果，便于对鸡是否感染H9N2亚型禽流感病毒做出快速诊断，有很好的推广意义。

附图说明

图1是本发明的快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的结构示意图；

图2是本发明的快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒内的检测卡结构示意图；

其中，1-盒体，2-检测卡，3-样品采集区,4-结果显示区，5-底板，6-吸水滤纸，7-显色垫，8-样品垫，9-检测区，10-质控区，11-保护垫，12-胶体金层。

具体实施方式

实施例1：一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体1和检测卡2，所述的盒体包括样品采集区3和结果显示区4；所述的检测卡镶嵌在盒体1中，包括底板5、吸水滤纸6、显色垫7和样品垫8，吸水滤纸6、显色垫7和样品垫8依次粘结在底板5上；所述的样品垫8包括保护垫11和胶体金层12，保护垫11卡在胶体金层12上方，所述的胶体金层12是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫7包括检测区9和质控区10，所述检测区9包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区10包被有兔抗鼠IgG抗体。

其中，所述的底板5为合成树脂材料制得，所述的合成树脂为高分子化合物，是由低分子原料氯乙烯通过聚合反应结合成大分子悬浮聚合生产的，悬浮聚合将单体在机械搅拌或振荡和分散剂的作用下，单体分散成液滴，通常悬浮于水中进行的聚合过程，这种方法物料粘度低，容易传热和控制，聚合后只需经过简单的分离、洗涤、干燥等工序，即得树脂产品，产品纯净、均匀；所述的检测区9包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体而形成的检测线，所述的质控区10包被有兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述的检测线采用抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体浓度为0.3mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用兔抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫11为医用皂化醋酸纤维素膜，所述的皂化醋酯纤维是用纤维素为原料，经化学法转化成醋酸纤维素酯制成的化学纤维，耐光性较好，伸缩率低，不受待检成分中化学物质的影响。

一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法为：

步骤一、胶体金标记抗原溶液制备：

a.将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至100℃，再按3％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，反应10min，胶体金溶液由完全变成紫色，继续保持100℃加热，胶体金溶液变成紫红色后，停止加热并冷却至25℃，使用碳酸钾溶液调节pH至8.0，得到胶体金溶液，备用；

b.用制备好的PBS缓冲液将H9N2亚型禽流感病毒抗原稀释至蛋白含量为0.5mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液成分含量为8％BSA，3％蔗糖，0.8％NaCl和0.03％NaN3，再将稀释液在5℃条件下2400r/min离心10min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到1制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，在5℃条件下2400r/min离心30min，静置8h后，即得到胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原；

步骤二、样品垫制备：

a.将聚乙二醇200 12g、聚乙烯吡咯烷酮15g、牛血清白蛋白10g、屈立通X-1000 1ml、吐温20 5ml混合后用5mM磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH值9.3得到处理液，将所述的保护垫11浸泡于处理液中20min，取出于37℃恒温烘干后封存，备用；

b.将胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原溶液均匀喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，制得胶体金层12，再将胶体金层12与保护垫11粘结，即制得所述的样品垫8。

步骤三、显色垫7制备：将抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体稀释成浓度为0.3mg/mL的包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上得到检测线；将兔抗鼠IgG抗体稀释成浓度为1.0mg/mL包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃恒温干燥3h，封存，即得到所述的显色垫7；

步骤四、试剂盒制备：给底板5上粘结显色垫7，然后在显色垫7的上方粘结吸水滤纸6，显色垫7与吸水滤纸6相互交叠0.2mm，在显色垫7的下方粘结样品垫8，显色垫7和样品垫8之间相互交叠0.2mm，按5mm的宽度，25mm的长度进行切割裁剪，制得检测卡2，将检测卡2放在塑料壳体中，样品垫8与样品采集区3对准，显色垫7与结果显示区4对准，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。

实施例2：一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体1和检测卡2，所述的盒体包括样品采集区3和结果显示区4；所述的检测卡镶嵌在盒体1中，包括底板5、吸水滤纸6、显色垫7和样品垫8，吸水滤纸6、显色垫7和样品垫8依次粘结在底板5上；所述的样品垫8包括保护垫11和胶体金层12，保护垫11卡在胶体金层12上方，所述的胶体金层12是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫7包括检测区9和质控区10，所述检测区9包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区10包被有兔抗鼠IgG抗体。

其中，所述的底板5为合成树脂材料制得，所述的合成树脂为高分子化合物，是由低分子原料氯乙烯通过聚合反应结合成大分子悬浮聚合生产的，悬浮聚合将单体在机械搅拌或振荡和分散剂的作用下，单体分散成液滴，通常悬浮于水中进行的聚合过程，这种方法物料粘度低，容易传热和控制，聚合后只需经过简单的分离、洗涤、干燥等工序，即得树脂产品，产品纯净、均匀；所述的检测区9包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体而形成的检测线，所述的质控区10包被有兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述的检测线采用抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体浓度为0.4mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用兔抗鼠IgG抗体浓度为1.1mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫11为医用皂化醋酸纤维素膜，所述的皂化醋酯纤维是用纤维素为原料，经化学法转化成醋酸纤维素酯制成的化学纤维，耐光性较好，伸缩率低，不受待检成分中化学物质的影响。

一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法为：

步骤一、胶体金标记抗原溶液制备：

a.将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至100℃，再按4％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，反应15min，胶体金溶液由完全变成紫色，继续保持100℃加热，胶体金溶液变成紫红色后，停止加热并冷却至25℃，使用碳酸钾溶液调节pH至8.5，得到胶体金溶液，备用；

b.用制备好的PBS缓冲液将H9N2亚型禽流感病毒抗原稀释至蛋白含量为0.65mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液成分含量为8％BSA，3％蔗糖，0.8％NaCl和0.03％NaN3，再将稀释液在6.5℃条件下2700r/min离心15min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到1制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原， 在6.5℃条件下2700r/min离心45min，静置10h后，即得到胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原；

步骤二、样品垫制备：

a.将聚乙二醇200 13.5g、聚乙烯吡咯烷酮17.5g、牛血清白蛋白12.5g、屈立通X-1000 1.25ml、吐温20 6.5ml混合后用7.5mM磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH值9.4得到处理液，将所述的保护垫11浸泡于处理液中25min，取出于37℃恒温烘干后封存，备用；

b.将胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原溶液均匀喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，制得胶体金层12，再将胶体金层12与保护垫11粘结，即制得所述的样品垫8。

步骤三、显色垫7制备：将抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体稀释成浓度为0.4mg/mL的包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上得到检测线；将兔抗鼠IgG抗体稀释成浓度为1.1mg/mL包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃恒温干燥4h，封存，即得到所述的显色垫7；

步骤四、试剂盒制备：给底板5上粘结显色垫7，然后在显色垫7的上方粘结吸水滤纸6，显色垫7与吸水滤纸6相互交叠0.2mm，在显色垫7的下方粘结样品垫8，显色垫7和样品垫8之间相互交叠0.2mm，按6.5mm的宽度，27.5mm的长度进行切割裁剪，制得检测卡2，将检测卡2放在塑料壳体中，样品垫8与样品采集区3对准，显色垫7与结果显示区4对准，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。

实施例3：一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒，包括盒体1和检测卡2，所述的盒体包括样品采集区3和结果显示区4；所述的检测卡镶嵌在盒体1中，包括底板5、吸水滤纸6、显色垫7和样品垫8，吸水滤纸6、显色垫7和样品垫8依次粘结在底板5上；所述的样品垫8包括保护垫11和胶体金层12，保护垫11卡在胶体金层12上方，所述的胶体金层12是由涂有胶体金颗粒标记的H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜制成，所述的显色垫7包括检测区9和质控区10，所述检测区9包被有抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体，所述的质控区10包被有兔抗鼠IgG抗体。

其中，所述的底板5为合成树脂材料制得，所述的合成树脂为高分子化合物， 是由低分子原料氯乙烯通过聚合反应结合成大分子悬浮聚合生产的，悬浮聚合将单体在机械搅拌或振荡和分散剂的作用下，单体分散成液滴，通常悬浮于水中进行的聚合过程，这种方法物料粘度低，容易传热和控制，聚合后只需经过简单的分离、洗涤、干燥等工序，即得树脂产品，产品纯净、均匀；所述的检测区9包被有H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体而形成的检测线，所述的质控区10包被有兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述的检测线采用抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体浓度为0.5mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用兔抗鼠IgG抗体浓度为1.2mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫11为医用皂化醋酸纤维素膜，所述的皂化醋酯纤维是用纤维素为原料，经化学法转化成醋酸纤维素酯制成的化学纤维，耐光性较好，伸缩率低，不受待检成分中化学物质的影响。

一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法为：

步骤一、胶体金标记抗原溶液制备：

a.将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至100℃，再按5％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，反应20min，胶体金溶液由完全变成紫色，继续保持100℃加热，胶体金溶液变成紫红色后，停止加热并冷却至25℃，使用碳酸钾溶液调节pH至9.0，得到胶体金溶液，备用；

b.用制备好的PBS缓冲液将H9N2亚型禽流感病毒抗原稀释至蛋白含量为0.8mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液成分含量为8％BSA，3％蔗糖，0.8％NaCl和0.03％NaN3，再将稀释液在8℃条件下3000r/min离心20min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到1制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，在8℃条件下3000r/min离心60min，静置12h后，即得到胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原；

步骤二、样品垫制备：

a.将聚乙二醇200 15g、聚乙烯吡咯烷酮20g、牛血清白蛋白15g、屈立通X-1000 1.5ml、吐温20 8ml混合后用10mM磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH值9.5得到处理液，将所述的保护垫11浸泡于处理液中30min，取出于37℃恒温烘干后封存，备用；

b.将胶体金标记的H9N2亚型禽流感病毒抗原溶液均匀喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，制得胶体金层12，再将胶体金层12与保护垫11粘结，即制得 所述的样品垫8。

步骤三、显色垫7制备：将抗H9N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体稀释成浓度为0.5mg/mL的包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上得到检测线；将兔抗鼠IgG抗体稀释成浓度为1.2mg/mL包被液，均匀喷射到硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃恒温干燥5h，封存，即得到所述的显色垫7；

步骤四、试剂盒制备：给底板5上粘结显色垫7，然后在显色垫7的上方粘结吸水滤纸6，显色垫7与吸水滤纸6相互交叠0.2mm，在显色垫7的下方粘结样品垫8，显色垫7和样品垫8之间相互交叠0.2mm，按8mm的宽度，30mm的长度进行切割裁剪，制得检测卡2，将检测卡2放在塑料壳体中，样品垫8与样品采集区3对准，显色垫7与结果显示区4对准，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测H9N2亚型禽流感病毒的试剂盒。

试剂盒特异性检测

特异性检测：灭活的H9N2亚型禽流感病毒60份为待测样品，分别用由实施例1、实施例2、实施例3制备的试剂盒进行检测，检测方法如下：将待测样品滴加到试剂盒的样品采集区中，任其沿着试剂盒内的检测卡自由扩散，5-10min内观察结果。

结果：灭活H9N2亚型禽流感病毒出现一条红色检测线和一条红色质控线，则结果判定为阳性，只出现一条红色质控线，结果判定为阴性，如果无红色线出现则失效，经过试验得出三组实施例制备的试剂盒对灭活的H9N2亚型禽流感病毒检测的准确率为100％，特异性明确。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。