一种胆固醇含量的检测方法与流程

本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种胆固醇含量的检测方法。

背景技术：

胆固醇又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。胆固醇经代谢还能转化为胆汁酸、类固醇激素、7-脱氢胆固醇，并且7-脱氢胆固醇经紫外线照射就会转变为维生素D3。胆固醇主要来自人体自身的合成，食物中的胆固醇是次要补充。专家建议每天摄入50mg～300mg胆固醇为佳。过分忌食含胆固醇的食物，易造成贫血，降低人体的抵抗力；但长期大量摄入胆固醇，不利于身体健康，会使血清中的胆固醇含量升高，增加患心血管疾病的风险。所以，科学的饮食方法提倡适量摄入胆固醇。

动物性食物(鱼肉蛋奶等)普遍含有胆固醇，植物性食物则普遍不含胆固醇。日常食物如猪脑、动物内脏、蛋黄、鱿鱼、贝壳类及奶油、黄油、羊油、猪油、牛油等动物油脂中含有较多胆固醇。动物油脂中的饱和脂肪酸还可以促进肝脏合成更多的胆固醇。虽然，饮食中胆固醇摄入并不是血液中胆固醇的主要来源，但控制饮食中胆固醇的摄入(避免摄入过多胆固醇)仍然是防治血脂异常、高血压、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要措施。因此，检测食品尤其是动物油脂等高胆固醇含量食品中胆固醇的含量是必不可少的。

目前，胆固醇的定量分析方法主要包括比色法、酶法、气相色谱法和高效液相色谱法。传统的比色法由于操作手续繁杂，特别是样品的前处理和样品中脂肪的提取，而且所需试剂多，造成了比色结果的偏差和计算结果的复杂化，且成本高，从而限定了该方法的广泛使用。酶法由于技术含量较高，特异性强。而其它两种方法有需要特殊的设备，检测时间较长，同时由于样品中杂质较多，导致分离效果差，检测结果的准确率难以保证。因此，急需提供一种可快速、准确检测食品中胆固醇含量的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种胆固醇含量的检测方法。该检测方法可大幅度缩短检测时间，提高检测的准确率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种胆固醇含量的检测方法，包括如下步骤：

将待测样品溶于有机溶剂，得到供试液，采用气质联用技术检测供试液中胆固醇的含量；

有机溶剂为异辛烷、乙醚或正己烷中的一种或两种以上的混合物。

作为优选，以g/mL计，待测样品与有机溶剂的用量比为(0.2～0.4)：10。

作为优选，气质联用技术的进样口温度为240～260℃，分流比为20:1。

优选地，气质联用技术的进样口温度为250℃。

作为优选，进样量为1～10μL。

在本发明提供的实施例中，进样量为1μL。

作为优选，气质联用技术的色谱柱为HP-5ms色谱柱。

作为优选，色谱柱的规格为30m*0.25mm*0.25μm。

作为优选，气质联用技术的流速为1.5～2.0mL/min。

优选地，气质联用技术的流速为1.5mL/min。

作为优选，气质联用技术的柱温为260～280℃，保持10～15min。

优选地，气质联用技术的柱温为275℃，保持13min。

作为优选，气质联用技术以氦气为载气。

在本发明提供的实施例中，氦气的纯度为99.999％。

作为优选，气质联用技术的接口温度为280～300℃。

优选地，气质联用技术的接口温度为280℃。

作为优选，气质联用技术所采用的离子源为EI离子源，离子源的电离电压为70eV。

在本发明提供的实施例中，气质联用技术的质谱特征离子的质荷比为386、275、105。

作为优选，气质联用技术的电子倍增器电压为在自动谐调电压值基础上增加150～200V。

优选地，气质联用技术的电子倍增器电压为在自动谐调电压值基础上增加200V。

在本发明提供的实施例中，气质联用技术的检测器为MSD检测器。

在本发明提供的实施例中，胆固醇的含量采用外标法测定。

作为优选，在将待测样品溶于有机溶剂与得到供试液之间还包括过滤的步骤。

在本发明提供的实施例中，采用0.45μm水相滤膜过滤。

本发明提供了一种胆固醇含量的检测方法。该检测方法包括：将待测样品溶于有机溶剂，得到供试液，采用气质联用技术检测供试液中胆固醇的含量；有机溶剂为异辛烷、乙醚或正己烷中的一种或两种以上的混合物。本发明具有如下有益效果：

1、本发明检测方法采用气质联用技术检测样品中胆固醇的含量，与现有的液相色谱技术方法相比，本发明检测方法样品处理流程简化很多，无需皂化，只需要20min/批，而现有的液相色谱技术样品处理时间为300min/批，本发明检测方法可大幅度缩短检测时间。

2、本发明检测方法采用选择离子扫描，专属性强，目标峰单一，排除杂质干扰，同时能够解决在皂化、衍生过程中造成提取不完全的问题，从而可提高检测的准确率；而现有方法由于样品杂质多，导致分离效果差，检测结果准确率难以保证。

3、通过对本发明胆固醇含量的检测方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明本发明方法科学有效，能对动植物等样品中的胆固醇含量起到质量控制的目的。

附图说明

图1～5分别为标准序号为STD1～STD5对照品的色谱图，示本发明检测方法的线性关系；

图6示根据标准序号为STD1～STD5对照品中胆固醇的浓度绘制的标准工作曲线；

图7～12为对照品溶液重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的精密度；

图13～18为试样重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的重复性；

图19～24为对照品溶液在室温下放置0h、2h、4h、6h、12h、24h后得到的色谱图，示本发明检测方法的稳定性；

图25示空白溶液的色谱图；

图26示本发明检测方法的检出限，其中，26-1和26-3为基线噪音图；26-3显示噪声区域为9.62到10.49分钟，最大噪声41.0，最小噪声40.0；26-2示目标峰，信号区域为8.45到8.62分钟，峰高43；

图27示本发明检测方法的定量限，其中，27-1和27-3为基线噪音图；27-3显示噪声区域为9.62到10.49分钟，最大噪声41.0，最小噪声40.0；27-2示目标峰，信号区域为8.45到8.62分钟，峰高63；

图28～36为序号为1～9样品(1-3为低浓度，4-6为中浓度，7-9为高浓度)的色谱图，示本发明检测方法的回收率；

图37示采用本发明检测方法检测胆固醇浓度的图谱；

图38示对比例1检测方法的图谱。

具体实施方式

本发明公开了一种胆固醇含量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明原理：试样中的胆固醇用有机溶剂提取后，用气质联用仪检测，并用外标法定量。

本发明提供的胆固醇含量的检测方法中所用标准品、试剂、仪器等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1胆固醇含量的检测

(一)检测方法

仪器：安捷伦气质联用仪。

试剂试药：

异辛烷(AR)；

胆固醇对照品来源：DR批号:00219纯度:95.0％。

分析步骤：

(1)仪器参数

进样口：250℃；进样量：1μL；分流比：20：1。

色谱柱：流速1.5mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm。

柱箱：柱温275℃，保持13min。

载气：氦气(99.999％)。

接口温度：280℃。

电离模式：EI电离电压：70eV。

选择离子：386(定量)，275，105。

电子倍增器电压：自动调谐值增加200V。

检测器：MSD。

(2)对照储备液的配制：

精密称取胆固醇对照品20mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入异辛烷溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

(3)标准工作曲线绘制：

分别精密移取胆固醇储备液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得工作标准液。

(4)试样制备：

精密称取样品0.3g，置于10mL容量瓶中，加异辛烷溶解并定容至刻度，摇匀，经0.45μm的水相滤膜过滤，即得供试液。

(5)结果计算：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品胆固醇的含量，mg/g；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中胆固醇的浓度，mg/mL。

(二)方法学验证

(1)线性范围确认

①试验数据(色谱图见附图1～5)：

表1胆固醇的线性关系试验数据

②标准工作曲线图：

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图6所示。

③线性试验结论：

线性评价：胆固醇的相关系R²为0.999，所以用该方法测定胆固醇在浓度0.06061mg/mL至0.6061mg/mL之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99】。

(2)精密度试验

①试验方法：

将胆固醇的对照品溶液按第4部分的色谱条件重复测定6次，计算其峰面积RSD(％)。

②试验数据(色谱图见附图7～12)：

表2胆固醇的精密度试验数据

③试验结论：

胆固醇重复测定6次峰面积的RSD(％)为0.4％，表明该方法有较好的精密度。

(3)重复性试验

①试验方法：

称取6份样品，按第4部分的试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD(％)。

②试验数据(色谱图见附图13～18)：

表3胆固醇的重复性试验数据

③试验结论：

6份样品胆固醇含量的RSD(％)为1.4％，表明该方法有较好的重复性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤5.3％】。

(4)稳定性试验

①试验方法：

将胆固醇对照品溶液分别在室温下放置0h、2h、4h、6h、12h、24h后，按第4部分的色谱条件测定峰面积，计算其RSD(％)。

②试验数据(色谱图见附图19～24)：

表4胆固醇的稳定性试验数据

③试验结论：

胆固醇对照品溶液分别在室温下放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后，RSD(％)为0.6％，表明胆固醇对照品溶液在室温下12小时内的稳定性良好。

(5)空白试验

①试验方法：

不称取样品，按第4部分的试样制备方法处理空白溶液，按其色谱条件测定空白溶液，与胆固醇对照品溶液的出峰时间对比。

②试验结果见图25。

③试验结论：

空白溶液在胆固醇的出峰时间处均无吸收峰，表明空白对测定结果基本无干扰。

(6)检出限与定量限试验

分析方法的定量限和检出限由信噪比(S/N)计算。

当信噪比(S/N)为3时，胆固醇检出限为0.12μg/mL，得到方法的胆固醇检出限为0.004mg/g(图26)。

当信噪比(S/N)为10时，胆固醇定量限为0.43μg/mL，得到方法的胆固醇定量限为0.014mg/g(图27)。

(7)回收率试验

①试验方法：

加标：精密称取约0.3g样品9份(已知胆固醇含量：5.70mg/g)，置于10mL容量瓶中，分成3组，每组3份，各组分别精密加入胆固醇的标准液(浓度为0.39805mg/mL)4.0mL、5.0mL、6.0mμL。按第4部分的试样制备方法处理样品。

②试验数据如下(色谱图见附图28～36)：

表5胆固醇的回收率试验数据

测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量

回收率(％)＝测得加入量/理论加入量

③试验结论：

胆固醇平均回收率为：99.2％，相对标准偏差(RSD)为0.7％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为90—110％】。

结论：

通过对胆固醇的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对动植物中的胆固醇含量起到质量控制的目的。

实施例2胆固醇含量的检测

分析步骤：

(1)仪器参数

进样口：240℃；进样量：1μL；分流比：20：1。

色谱柱：流速1.8mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm。

柱箱：柱温260℃，保持13min。

载气：氦气(99.999％)。

接口温度：290℃。

电离模式：EI电离电压：70eV。

选择离子：386(定量)，275，105。

电子倍增器电压：自动调谐值增加150V。

检测器：MSD。

(2)对照储备液的配制：

精密称取胆固醇对照品20mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入乙醚溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

(3)标准工作曲线绘制：

分别精密移取胆固醇储备液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得工作标准液。

(4)试样制备：

精密称取样品0.3g(5.21mg/g)，置于10mL容量瓶中，加乙醚溶解并定容至刻度，摇匀，经0.45μm的水相滤膜过滤，即得供试液(胆固醇浓度为0.1563mg/mL)。

(5)结果计算与实施例1相同。

X＝C×V/M×K

式中：X—样品胆固醇的含量，mg/g；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中胆固醇的浓度，mg/mL。

表6胆固醇含量检测结果

试验结果：采用本实施例检测方法测定的胆固醇浓度与预期相近，表明本发明检测方法能够准确检测样品中胆固醇的含量。

实施例3胆固醇含量的检测

分析步骤：

(1)仪器参数

进样口：260℃；进样量：1μL；分流比：20：1。

色谱柱：流速2.0mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm。

柱箱：柱温280℃，保持13min。

载气：氦气(99.999％)。

接口温度：300℃。

电离模式：EI电离电压：70eV。

选择离子：386(定量)，275，105。

电子倍增器电压：自动调谐值增加180V。

检测器：MSD。

(2)对照储备液的配制：

精密称取胆固醇对照品20mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入正己烷溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

(3)标准工作曲线绘制：

分别精密移取胆固醇储备液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得工作标准液。

(4)试样制备：

精密称取样品0.3g(5.21mg/g)，置于10mL容量瓶中，加正己烷溶解并定容至刻度，摇匀，经0.45μm的水相滤膜过滤，即得供试液(胆固醇浓度为0.1563mg/mL)。

(5)结果计算与实施例1相同。

X＝C×V/M×K

式中：X—样品胆固醇的含量，mg/g；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中胆固醇的浓度，mg/mL。

表7胆固醇含量检测结果

试验结果：采用本实施例检测方法测定的胆固醇浓度与预期相近，表明本发明检测方法能够准确检测样品中胆固醇的含量。

实施例4检测实例

分析步骤：

1仪器参数

进样口：250℃；进样量：1μL；分流比：20：1；

色谱柱：流速1.5mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm；

柱箱：柱温275℃，保持13min；

载气：氦气(99.999％)；

接口温度：280℃；

电离模式：EI电离电压：70eV；

选择离子：386(定量)，275，105；

电子倍增器电压：自动调谐值增加200V。

2对照储备液的配制：

精密称取胆固醇对照品20-30mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入异辛烷溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

3标准工作曲线绘制：

分别精密移取胆固醇储备液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得工作标准液。

4试样制备：

精密称取样品0.2-0.4g，置于10mL容量瓶中，加异辛烷溶解并定容至刻度，摇匀，经0.45μm的水相滤膜过滤，即得供试液。

5结果计算：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品胆固醇的含量，mg/g；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝1)；

V—样品的稀释倍数，mL；

C—样品溶液中胆固醇的浓度，mg/mL。

试验结果：

表8胆固醇含量检测结果

对比例1液相色谱检测方法

原理：试样中的胆固醇经有机溶剂提取，用液相色谱仪分析，采用外标法定量。

分析方法：

1色谱参考条件

1.1色谱柱：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)或同等性能的色谱柱；

1.2柱温：35℃；

1.3检测波长：205nm；

1.4流速：1.0mL/min；

1.5流动相：甲醇。

2溶液制备

2.1对照品溶液的制备：精密称取胆固醇对照品适量(精确至0.01mg)，置50mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.2mg胆固醇的对照品溶液，经0.45μm的滤膜过滤，即得。

2.2供试品溶液制备：取试样20粒(片)或10g(若试样为胶囊，应取内容物)，混合均匀，称取样品0.25g～10g(胆固醇含量约为0.5mg～5mg，精确至0.1mg)于250mL平底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，10mL60％氢氧化钾溶液，混匀。将试液在100℃磁力搅拌水浴加热皂化回流1h，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，用5mL无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部，取下平底烧瓶，冷却至室温。

2.3样品提取处理：定量转移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL水分2次～3次冲洗烧瓶，洗液并入分液漏斗，再用40mL石油醚和乙醚混合液(1+1，体积比)分2次～3次冲洗平底烧瓶并入分液漏斗，振摇2min，静置，分层。转移水相于第二个分液漏斗，再用30mL石油醚和乙醚混合液(1+1，体积比)重复提取两次，弃去水相，合并三次有机相，用蒸馏水每次100mL洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化，提取液通过约10g无水硫酸钠脱水，转移至150mL烧瓶中。

2.4样品浓缩：将上述烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干，用无水乙醇溶解定容至25mL，溶液通过0.45μm过滤膜过滤，收集清夜于进样瓶中，进色谱测定。

3测定

分别精密吸取对照品溶液2μL、5μL、10μL、20μL、30μL与供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，建立标准曲线方程。供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰定量。

4结果计算

X＝V×C/M

式中：

X—样品中胆固醇含量，mg/g；

C—样品溶液中胆固醇的浓度，mg/mL；

M—样品的质量，g；

V—样品稀释的体积，mL。

5试验结果

表9胆固醇含量检测结果

结论：

通过对比例1旧方法与实施例4气质方法对比，结果显示：气质方法样品处理流程简化很多，旧方法处理时间为300min/批，而气质方法只需要20min/批，大幅度缩短检测时间。且旧方法由于样品杂质多，导致分离效果差，检测结果准确率难以保证；而气质方法采用选择离子扫描，专属性强，目标峰单一，更能提高检测的准确率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。