本发明分析化学领域，尤其涉及一种测定苁蓉总苷胶囊中的活性成分的方法。
背景技术：
苁蓉总苷胶囊是以管花肉苁蓉中提取所得的肉苁蓉总苷为原料制备而成的单方制剂，具有补肾益髓，健脑益智的作用，临床上用于治疗髓海不足证的轻中度血管性痴呆。根据苁蓉总苷胶囊化学成分研究结果，现已明确的有机酚酸类和苯乙醇苷类成分分别为绿原酸，咖啡酸，松果菊苷，毛蕊花糖苷，管花苷a和异毛蕊花糖苷，且已建立上述苯乙醇苷类多成分同时测定的定量方法。但由于对照品不易获得，价格昂贵，直接限制了用常规外标法来实现其多指标质量控制的目的，导致其方法无法在生产实践中得到应用。
因此，提供一种降低测试苁蓉总苷胶囊中有效成分的成本是目前需要解决的技术问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种测定苁蓉总苷胶囊中的活性成分的方法，本发明提供的检测方法检测检测成本低。
本发明提供了一种测定苁蓉总苷胶囊中活性成分的方法，包括：
1)通过采用超高效液相色谱对对照样进行检测，得到毛蕊花糖苷与管花苷a的校正因子f毛蕊花糖苷/管花苷a、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的校正因子f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷与松果菊苷的校正因子f毛蕊花糖苷/松果菊苷，
所述超高效液相色谱检测用流动相为乙腈和0.1vol％甲酸水溶液；
2)采用与步骤1)相同的超高效液相色谱检测条件检测苁蓉总苷胶囊待测样中的毛蕊花糖苷的含量，得到待测样中毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积；
3)通过步骤1)得到的校正因子以及步骤2得到的毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积计算得到管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量。
优选的，所述步骤1)的检测中，流动相的洗脱为梯度洗脱。
优选的，所述梯度洗脱中，以乙腈作为a相，0.1vol％甲酸水溶液作为b相，洗脱程序为：0～5min：9～13％a，5～15min：13～15％a，15～22min：15～17％a，22～27min：17～23％a，27～35min：23～35％a。
优选的，所述步骤1)中流动相的流速为0.15～0.25ml/min。
优选的，所述步骤1)中检测的柱温为28～32℃。
优选的，所述步骤1)中检测的波长为325～335nm。
优选的，所述苁蓉总苷胶囊待测样按照以下方法制备：
取苁蓉总苷胶囊装量差异项下内容物与甲醇混合，超声，取上清液，即得苁蓉总苷胶囊待测样。
优选的，所述苁蓉总苷胶囊装量差异项下内容物与所述甲醇的用量比为0.1g：(300～400)ml。
优选的，所述得到的f毛蕊花糖苷/管花苷a的值优选为1.250～1.350，更优选为1.280～1.346，最优选1.346；所述得到的f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷的值优选为1.250～1.330，更优选为1.266～1.270，最优选为1.266；所述得到的f毛蕊花糖苷/松果菊苷的值优选为1.050～1.200，更优选为1.135～1.145，最优选为1.135；
所述超声的时间为20～40min。
与现有技术相比，本发明提供一种测定苁蓉总苷胶囊中的活性成分的方法，通过采用超高效液相色谱对对照样进行检测，得到毛蕊花糖苷与管花苷a的校正因子f毛蕊花糖苷/管花苷a、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的校正因子f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷与松果菊苷的校正因子f毛蕊花糖苷/松果菊苷，并采用与检测对照样相同的超高效液相色谱检测条件检测苁蓉总苷胶囊待测样中的毛蕊花糖苷的含量，得到待测样中毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积；然后通过得到的校正因子以及待测样的色谱图得到其它三种成分的含量，其中，在超高效液相色谱检测时通过使流动相为乙腈和0.1vol％甲酸水溶液；并使毛蕊花糖苷作为内参物，使得得到的校正因子计算得到的管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量准确，且仅仅使用一种对照品即可实现四种样品的同时测定，大大节约了成本；实验结果表明，本发明提供的检测方法得到的待测样中各组分的含量与标准曲线法得到的各组分的含量无显著性差异；此外，本发明提供的检测条件还能够将绿原酸与咖啡酸很好的分离。
附图说明
图1为混合对照品溶液和供试品溶液在330nm处的uplc图。
具体实施方式
本发明提供了一种测定苁蓉总苷胶囊中活性成分的方法，包括：
1)通过采用超高效液相色谱对对照样进行检测，得到毛蕊花糖苷与管花苷a的校正因子f毛蕊花糖苷/管花苷a、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的校正因子f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷与松果菊苷的校正因子f毛蕊花糖苷/松果菊苷，
所述超高效液相色谱检测用流动相为乙腈和0.1vol％甲酸水溶液；
2)采用与步骤1)相同的超高效液相色谱检测条件检测苁蓉总苷胶囊待测样中的毛蕊花糖苷的含量，得到待测样中毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积；
3)通过步骤1)得到的校正因子以及步骤2得到的毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积计算得到管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量。
按照本发明，本发明通过采用超高效液相色谱对对照样进行检测，得到毛蕊花糖苷与管花苷a的校正因子f毛蕊花糖苷/管花苷a、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的校正因子f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷与松果菊苷的校正因子f毛蕊花糖苷/松果菊苷；其中，所述检测用色谱柱为优选为agilentsb-c18rrhd；所述检测用流动相为乙腈和0.1vol％甲酸水溶液；所述流动相的洗脱优选为梯度洗脱，所述梯度洗脱中，以乙腈作为a相，0.1vol％甲酸水溶液作为b相，洗脱程序为：0～5min：9～13％a，5～15min：13～15％，15～22min：15～17％a，22～27min：17～23％a，27～35min：23～35％a；所述流动相的流速优选为0.15～0.25ml/min，更优选为0.19～0.21ml/min；所述检测的柱温优选为28～32℃，更优选为30～31℃；所述检测的波长优选为325～335nm，更优选为330nm；所述进样量优选为2μl。
所述得到的f毛蕊花糖苷/管花苷a的值优选为1.250～1.350，更优选为1.280～1.346，最优选1.346；所述得到的f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷的值优选为1.250～1.330，更优选为1.266～1.270，最优选为1.266；所述得到的f毛蕊花糖苷/松果菊苷的值优选为1.050～1.200，更优选为1.135～1.145，最优选为1.135；
另外，梯度洗脱中，％a指的是体积比，如9～13％a是指每100ml洗脱剂中含有9～13ml的a；vol％是指体积百分含量。
按照本发明，本发明还采用与步骤1)相同的超高效液相色谱检测条件检测苁蓉总苷胶囊待测样中的毛蕊花糖苷的含量，得到待测样中毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a的峰面积、异毛蕊花糖苷的峰面积和松果菊苷的峰面积；其中，该步骤中，与步骤1)相同的检测条件是指出待检测的样不同以外，其它测试条件均相同，如检测的流动相、洗脱方式、检测的柱温、流动相流速等都相同。
所述苁蓉总苷胶囊待测样优选按照以下方法制备：取苁蓉总苷胶囊装量差异项下内容物与甲醇混合，超声，取上清液，即得苁蓉总苷胶囊待测样。所述苁蓉总苷胶囊装量差异项下内容物与所述甲醇的用量比优选为0.1g：(300～400)ml，更优选为0.1g：(330～350)ml；所述超声的时间为20～40min，更优选为30～35min，所述超声的功率优选为200～300w，更优选为250～280w。
按照本发明，通过步骤1)得到的校正因子以及步骤2得到的毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积计算得到管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量，本发明对计算的方法没有特殊要求，按照一测多评法给出的计算公式计算得到即可。
本发明提供一种测定苁蓉总苷胶囊中的活性成分的方法，通过采用超高效液相色谱对对照样进行检测，得到毛蕊花糖苷与管花苷a的校正因子f毛蕊花糖苷/管花苷a、毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的校正因子f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷与松果菊苷的校正因子f毛蕊花糖苷/松果菊苷，并采用与检测对照样相同的超高效液相色谱检测条件检测苁蓉总苷胶囊待测样中的毛蕊花糖苷的含量，得到待测样中毛蕊花糖苷的含量以及管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的峰面积；然后通过得到的校正因子以及待测样的色谱图得到其它三种成分的含量，其中，在超高效液相色谱检测时通过使流动相为乙腈和0.1vol％甲酸水溶液；并使毛蕊花糖苷作为内参物，使得得到的校正因子计算得到的管花苷a、异毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量准确，且仅仅使用一种对照品即可实现四种样品的同时测定，大大节约了成本；且该检测方法得到的待测样中各组分的含量与标准曲线法得到的各组分的含量无显著性差异，此外，本发明提供的检测条件还能够将绿原酸与咖啡酸很好的分离。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、仪器与材料
agilent1290超高效液相色谱仪(dad紫外检测器)；色谱柱：agilentsb-c18rrhd(3.0×100mm，1.8μm)，agilentsb-c18rrht(3.0×100mm，1.8μm)，agilentxdb-c18rrht(3.0×100mm，1.8μm)。乙腈，甲酸为色谱纯(进口分装)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
绿原酸对照品(批号：110753-201415)，咖啡酸对照品(批号：110885-200102)，松果菊苷对照品(批号：111670-201505)，毛蕊花糖苷对照品(批号：111530-201310)均由中国食品药品检定研究院提供；管花苷a对照品(批号：150629)，异毛蕊花糖苷对照品(批号：15111802)均由成都普菲德生物技术有限公司提供。苁蓉总苷胶囊(批号：1310011,1310021,1310031)，均由江苏康缘药业股份有限公司提供。
2、方法与结果
2.1色谱条件的选择
2.1.1检测波长的选择
本实验在190～400nm对供试品溶液中待测成分进行了全波长扫描，结果绿原酸，咖啡酸，松果菊苷，毛蕊花糖苷，管花苷a和异毛蕊花糖苷在325～335nm波长处均有最大吸收峰，因此选择330nm作为检测波长，结果表明在此检测波长条件下，各待测成分分离度良好。
2.1.2柱温的选择
对于不同柱温的f耐用性考察中，采用aglient1290超高效液相色谱系统和agilentc18色谱柱，分别考察了不同柱温(25，28，30，32，35℃)对各相对校正因子的影响，结果25℃条件下毛蕊花糖苷与管花苷a不能完全分离，35℃条件下咖啡酸与相邻色谱峰不能完全分离，表明此方法对对柱温有一定的耐用范围受限，在28～32℃范围内耐用性良好。
2.1.3具体检测方法
色谱柱为agilentsb-c18rrhd(3.0×100mm，1.8μm)；以乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)为流动相；梯度洗脱：0～5min：9～13％a，5～15min：13～15％，15～22min：15～17％a，22～27min：17～23％a，27～35min：23～35％；体积流量：0.2ml·min-1；柱温：30℃；检测波长：330nm；进样量：2μl。此条件下各待测成分分离度良好，色谱图见图1，图1混合对照品溶液和供试品溶液在330nm处的uplc图，其中，a混合对照品b.苁蓉总苷胶囊供试品，1.绿原酸2.咖啡酸3.松果菊苷4.毛蕊花糖苷5.管花苷a6.异毛蕊花糖苷
2.2对照品溶液和供试品溶液的制备
2.2.1供试品溶液(苁蓉总苷胶囊待测样)制备方法的选择
本实验进行了不同提取溶剂，不同提取方式，不同提取时间，不同溶剂用量的供试品溶液制备方法的考察。通过考察30％甲醇，50％甲醇，70％甲醇，100％甲醇，30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，100％乙醇发现，100％甲醇作为提取溶剂时得到的峰形较好且待测成分含量较高；考察不同提取方式(超声，回流)的不同提取时间(5min，10min，15min，30min，45min，60min)发现，超声与回流方式对含量影响不大，由于超声较方便，故选超声作为提取方式，且待测成分含量随超声时间呈递增趋势，但30min后含量变化不大，故最终选择超声30min。
2.2.2对照品溶液(对照样)的制备
精密称取绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷对照品适量，分别加入甲醇溶解并稀释制成每1ml中含7.43μg，10.20μg，109.46μg，123.97μg，210.40μg和1214.24μg的混合对照品溶液，摇匀，即得对照样(对照品)。
2.2.3供试品溶液的制备
取苁蓉总苷胶囊装量差异项下内容物约0.15g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50ml甲醇，超声30min(250w，40hz)，放冷，再精密量取1ml到10ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心(12000r·min-1，5min)，取上清液，即得苁蓉总苷胶囊待测样。
2.3线性关系考察
分别精密吸取混合对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，10.0ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述溶液各2μl，注入超超高效液相色谱仪，测定，以对照品质量浓度为横坐标(x)，以峰面积积分值为纵坐标(y)，进行线性回归，得回归方程：绿原酸：y＝26.11x+0.07223，r2＝0.99998，线性范围：0.1858～7.4315μg·ml-1；咖啡酸：y＝46.899x+2.2435，r2＝0.99998，线性范围：0.2550～10.2000μg·ml-1；毛蕊花糖苷：y＝16.21x+0.99338，r2＝0.99998，线性范围：2.7364～109.4550μg·ml-1；管花苷a：y＝12.104x-0.54241，r2＝0.99995，线性范围：3.0993～123.9702μg·ml-1；异毛蕊花糖苷：y＝12.825x+1.8102，r2＝0.99999，线性范围：5.2602～210.4064μg·ml-1；松果菊苷：y＝14.792x-82.167，r2＝0.9997，线性范围：30.3559～1214.2355μg·ml-1。
2.4精密度试验
精密吸取高，中，低不同浓度混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷峰面积的rsd值分别为0.44％，0.19％，0.16％，0.15％，0.20％，0.95％(高)；1.37％，1.17％，1.05％，1.04％，1.06％，1.66％(中)；0.87％，0.60％，0.58％，0.60％，0.74％，0.75％(低)，表明在此条件下进样精密度良好。
2.5稳定性试验
取混合对照品溶液和供试品溶液(批号：1310011)，分别于0h，2h，4h，8h，12h，16h，20h，24h进样，记录峰面积，计算峰面积的rsd值。结果混合对照品溶液中绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷峰面积的rsd值分别为1.01％，0.70％，0.71％，0.56％，0.49％，0.49％；供试品溶液中绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷峰面积的rsd值分别为1.01％，1.96％，1.82％，1.58％，0.89％，1.16％，表明混合对照品溶液和供试品溶液在24h内稳定性均较好。
2.6重复性试验
取供试品溶液(批号：1310011)按供试品溶液制备方法平行制备制备6份，按上述色谱条件测各成分质量分数，计算rsd值，结果供试品溶液中绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷含量的rsd值分别为2.24％，1.44％，1.82％，2.04％，0.60％，0.44％，表明该方法的重复性较好。
2.7加样回收试验
精密称取苁蓉总苷胶囊装量差异项下内容物(批号：1310011)，平行9份，分3组，分别依次加入低，中，高3种不同浓度(低，中，高浓度对照品溶液加入量为所取供试品溶液待测成分含有量的50％，100％，150％)的绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷对照品，按上述色谱条件测定各成分质量分数，计算加样回收率与rsd值，结果绿原酸，咖啡酸，毛蕊花糖苷，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷的平均加样回收率分别为97.34％，100.96％，99.29％，103.27％，102.41％，98.72％；rsd值分别为1.05％，1.97％，1.61％，1.30％，1.50％，1.75％，表明此方法的准确度良好。
实施例2
相对校正因子的确定
1相对校正因子的测定
取实施例1“2.3项”下混合对照品溶液，按照实施例1中2.1.3部分的检测方法，每个样品进样2次，测定各成分的峰面积，计算各成分的平均峰面积，根据相对校正因子的计算公式，以绿原酸作为内参物计算咖啡酸的f，以毛蕊花糖苷作为内参物计算管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷的f，结果f绿原酸/咖啡酸，f毛蕊花糖苷/管花苷a，f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷，f毛蕊花糖苷/松果菊苷分别为0.538，1.346，1.266，1.135；rsd值分别为2.11％，0.28％，0.37％，1.65％，结果见表1。
表1各成分的相对校正因子
2不同体积流量对f的影响
不同体积流量分别为0.19ml·min-1，0.20ml·min-1，0.21ml·min-1时，考察其对各成分f的影响，结果rsd值分别为0.39％，1.90％，1.48％，1.95％，表明微调体积流量对各成分f无显著影响。
3不同柱温对f的影响
不同柱温分别为28℃，30℃，32℃时，考察其对各成分f的影响，结果rsd值分别为0.50％，2.65％，1.90％，2.47％，表明微调柱温对各成分f无显著影响。
4不同检测波长对f的影响
不同检测波长分别为328nm，330nm，332nm时，考察其对各成分f的影响，结果rsd值分别为2.06％，0.71％，1.77％，0.00％，表明微调检测波长对各成分f无显著影响。
5不同色谱柱对f的影响
考察同品牌同规格的不同色谱柱(agilentsb-c18rrhd(3.0×100mm，1.8μm)，agilentsb-c18rrht(3.0×100mm，1.8μm)，agilentxdb-c18rrht(3.0×100mm，1.8μm))对各成分f的影响，结果rsd值分别为0.48％，1.01％，1.48％，0.40％，表明这3根同品牌色谱柱对各成分f无显著影响。
6不同实验人员对f的影响
考察不同实验人员(实验人员a，实验人员b，实验人员c)对各成分f的影响，结果rsd值分别为1.69％，1.79％，0.64％，1.09％，表明不同实验人员操作所得各成分f无显著影响。
7各耐用性因素对f的综合影响
综合以上各种因素，f绿原酸/咖啡酸，f毛蕊花糖苷/管花苷a，f毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷，f毛蕊花糖苷/松果菊苷rsd值分别为1.09％，1.69％，1.58％，1.88％，结果见表2。
表2各种因素对相对校正因子的综合影响
实施例3
待测组分色谱峰的定位
按照实施例1中2.1.3部分的检测方法对待测物进行检测
通过采用相对保留时间进行待测成分色谱峰的定位，咖啡酸，管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷的平均相对保留时间分别为0.790，0.987，0.928，1.603，rsd值分别为0.96％，0.21％，0.38％，0.45％。
实施例4
qams法与标准曲线法测定结果的比较
按照实施例1中2.1.3部分的检测方法对待测物进行检测，采用标曲法对苁蓉总苷胶囊进行多种成分同时测定，再用建立的qams法(一测多评法)进行定量计算，以验证qams法用于苁蓉总苷胶囊中多指标质量评价的准确性，结果见表3，两种方法测得的苯乙醇苷类各成分的量无显著性差异，相对偏差(rd)＜5％，表明建立的方法具有可靠性。
表3标曲法(a)与qams法(b)测定管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷的结果
通过表3的结果可以看出，对标曲法与qams法测得的结果进行比较时，苯乙醇苷类各成分管花苷a，异毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量偏差均小于5％，由于毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量相差较大，使得两种方法测得的结果偏差较其他两种成分稍大，但均在偏差允许的范围内，表明本实验制定的qams法对苁蓉总苷胶囊中苯乙醇苷类成分的含量测定可靠。
而对于有机酚酸类成分两种方法测定结果的比较
对于有机酚酸类成分咖啡酸和绿原酸，虽然qams法其他可行性研究均满足要求，但两种方法测得的含量结果偏差较大。分析其可能的原因，一是咖啡酸与绿原酸在苁蓉总苷胶囊中的含量较低，二是结构差异，由于两者结构相差一个奎宁酸的结构，紫外吸收会有一定的差异，从而导致qams法和回归曲线法的含量结果有所差异。因此，从含量测定准确性的角度出发，建议苁蓉总苷胶囊中的绿原酸和咖啡酸采用外标法或线性回归方程法进行含量测定。
本研究采用uplc超高效液相色谱法对苁蓉总苷胶囊进行多成分含量同时测定，极大地节约了分析时间和流动相溶剂用量；且首次将qams法运用到苁蓉总苷胶囊的多指标质量评价模式中，并对所建立的qams法同时测定多种成分进行了可行性研究，结果表明qams法在对照品紧缺及多指标成分检测成本昂贵的情况下显示出巨大的优势，进而证明qams法在中药的多指标质量控制和评价模式中有良好的应用前景。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。