一种以树脂为载体的真菌毒素免疫亲和柱的制备方法与流程

本发明涉及的是一种以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯为基质的真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫亲和柱的制备方法，属于制备技术。

背景技术：

镰刀菌毒素是由真菌毒素产生的次级代谢产物，对人和家畜的健康有很大的危害，广泛存在于各种粮食作物和加工产品中，多见于潮湿环境中储藏的发霉粮食中。经常从受污染的粮食和饲料中被检出的有4种：T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA。对于粮食制品中镰刀菌毒素的测定分析方法主要为色谱法，大多需结合前处理步骤，如固相萃取(SPE)。然而，目前的SPE是基于理化功能的表面保留，除获得目标分析物外易混有其他基质成分，常规的固相萃取技术的缺点是对目标分析物选择性低。免疫亲和柱则是一种具有高选择性的高效净化技术，利用抗原抗体的特异性识别和结合实现单个化合物或一类化合物的选择性萃取。免疫亲和柱操作简便，可重复使用。在我国，虽然免疫亲和固相萃取技术在许多实验室已经广泛使用，但固相萃取材料还是主要依靠进口。目前市场上存在的免疫亲和柱，其填料大多以Sepharose4B凝胶多糖基质为主，供应厂商单一，使用成本高昂。选择其他基质作为填料，成为今后免疫亲和柱的研究方向。聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯(glycidyl methacrylate-divinylbenzene，简称GMA-DVB)材料不受pH的限制，机械强度大。一种高效的以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯为基质的镰刀菌毒素多目标(DON、ZEA、T-2、HT-2)免疫亲和柱，克服了多糖类基质免疫亲和柱机械强度差，pH应用范围窄和成本高的缺陷，又能实现几种真菌毒素的同时净化，大大节约时间和成本。

技术实现要素：

本发明提供一种以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯为基质的真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫亲和柱的制备方法，可以克服上述困难。

本发明是采用以下技术方案来实现的：一种以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯为基质的真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫亲和柱的制备方法，它包括抗体的制备和纯化、基质材料制备、配体偶联、装柱四个步骤，其特征在于：按比例取甲基丙烯酸环氧丙酯和二乙烯苯单体，加入0.1～0.3g过硫酸钾KBS作为反应的引发剂，使之充分溶解于两种单体中作为油相。向装有旋转子、温度计和冷凝管的三口烧瓶中加入单体质量的4～5倍去离子水，加入总水量0.5％的明胶和5％的氯化钠，开动搅拌并缓慢加热，升温到50℃将混合好的油相加入到三口烧内，通氮气以除去溶液中的氧气，然后升温到60～80℃保持2h，再升温至85℃继续反应，直到树脂定型，最后升温到90℃并保持2h。将合成的树脂过滤，用热水洗去明胶，冷却得聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯，37℃真空干燥24h。取聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯于二甲基亚砜中溶胀12h，加入装有旋转子、温度计和冷凝管的三口烧瓶中，并加入过量1，6-己二胺和三氟化硼乙醚作为催化剂，80℃，300r/min反应8h。加入乙二醇继续反应3h，封闭未反应的环氧基。反应结束后，过滤，用乙醇和去离子水各洗涤三次，得胺化聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯，37℃真空干燥24h。取胺化聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯微球，用pH 7.0的PBS缓冲液分散，超声30min，加入过量25％戊二醛，在29℃的振荡水浴锅中振荡反应(200r/min)3h，停止活化。然后用pH 5.0的0.2mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PBS)清洗3遍并溶解在此缓冲液中，得到树脂悬浮液。取1～5mg DON抗体、0.1～1mg T-2、HT-2抗体、0.2～1mg ZEA抗体，将上述抗体加入50％PBS-甘油溶液，再取上述活化过的树脂材料1mL(约0.3g)，将两者混合，25℃的振荡水浴锅中振荡反应12h。采用湿法装柱，每根柱子装入1mL凝胶，柱子装好后，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01％NaN₃-PBS过柱，并使用0.01％NaN₃-PBS保存。

本发明的优点和积极效果：

设计新颖，工艺先进，方法独特，用途广。不但解决了镰刀菌毒素在传统富集过程中存在的基质干扰、特异性低、成本高等问题，并且实现多目标同时净化，特异性强，机械强度高，pH适用范围广，极大地提高了免疫亲和柱的使用效率。本聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯镰刀菌毒素多目标免疫亲和柱的制备方法使镰刀菌毒素的多目标净化变得高效、快速、方便，且极具实用性、推广性。

附图说明

图例为本发明以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯为基质的真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫亲和柱的制备方法的示意流程图。

具体实施方式

由图例给出具体实施例。图例给出的是一种以聚甲基丙烯酸环氧丙酯-二乙烯苯为基质的真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫亲和柱制备的工艺流程图，它包括抗体的制备和纯化1、基质材料制备2、配体偶联3、装柱4。