一种试剂盒、试剂盒的制备方法及利用该试剂盒实现的外周血甘氨胆酸的检测方法与流程

技术特征：

1.一种试剂盒，其特征在于：包括试剂R1、试剂R2，

所述试剂R1含有：Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，抗牛磺酸抗体，抗甘氨胆酸抗体，G6P(葡萄糖-6-磷酸)；

所述试剂R2含有：Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，甘氨胆酸-G-6-PD偶联物(杭州博谱医药科技有限公司)，NADP(辅酶Ⅱ)，BSA(牛血清白蛋白)。

2.如权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：还包括标准液，

所述标准液为：取浓度为80μg/mL甘氨胆酸，用内含5g/L BSA、50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCL)缓冲液作倍比稀释成系列浓度溶液。

3.如权利要求2所述的一种试剂盒，其特征在于：还包括质控品，

所述质控品为：取甘氨胆酸钠盐(纯度97％)1.000mg溶解于6.25mL三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCL)缓冲液50mM，pH6.8，内含5g/L BSA；甘氨胆酸浓度为160μg/mL，然后再用健康人新鲜血清作1:8和1:32稀释。

4.如权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：所述抗牛磺酸抗体包括抗牛磺酸单克隆IgG抗体或抗牛磺酸多克隆IgG抗体。

5.如权利要求4所述的一种试剂盒，其特征在于：所述抗牛磺酸单克隆IgG抗体包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4中的一种；所述抗牛磺酸多克隆IgG抗体包含F(ab)’2特异性抗体片段。

6.如权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：所述抗甘氨胆酸抗体包括抗甘氨胆酸单克隆IgG抗体或抗甘氨胆酸多克隆IgG抗体。

7.如权利要求6所述的一种试剂盒，其特征在于：所述抗甘氨胆酸单克隆IgG抗体为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4中的一种；所述抗甘氨胆酸多克隆IgG抗体含F(ab)’2特异性抗体片段。

8.制备如权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于：其中的抗牛磺酸抗体的制备方法如下：利用牛磺酸上的-NH₂与蛋白质分子上的-COOH进行偶联；再利用这些偶联物免疫物作为免疫原进行免疫小鼠或家兔，最后获得特异性的抗牛磺酸抗体，牛磺酸与蛋白质或多聚赖氨酸的摩尔比是1:20-200，以1:100为优选；其中的抗甘氨胆酸抗体的制备方法如下：利用甘氨胆酸支链末端的-COOH与蛋白质或多聚赖氨酸分子上的-NH2进行偶联；再利用这些偶联物免疫物作为免疫原进行免疫小鼠或家兔，最后获得特异性的抗甘氨胆酸抗体，甘氨胆酸与蛋白质或多聚赖氨酸的摩尔比是1:20-200，以1:100为优选。

9.利用如权利要求1所述试剂盒实现的外周血甘氨胆酸的检测方法，其特征在于：采用免疫测定法，以均相酶免疫测定法为优先，先采用抗牛磺酸抗体封闭样本中可能存在的牛磺胆酸的干扰，再用抗甘氨胆酸抗体进行甘氨胆酸的检测；抗牛磺酸抗体的工作浓度为1-10μg/mL，以5μg/mL为优选。

10.利用如权利要求1所述试剂盒实现的外周血甘氨胆酸的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

将试剂R1与待测样品混合，25-37℃反应3-5min，再加入试剂R2，25-37℃反应5-10min，检测340nm处吸光值，根据标准曲线获得待测样品中甘氨胆酸浓度；

所述试剂R1质量组成为：

1-10μg/mL抗牛磺酸单克隆IgG抗体(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)或多克隆IgG抗体(包含F(ab)’2特异性抗体片段)，

10-100μg/mL抗甘氨胆酸牛磺酸单克隆IgG抗体(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)或多克隆IgG抗体(包含F(ab)’2特异性抗体片段)，

50-500μg/mL G6P，

0.01-0.5％Tween-20，

0.3-10mM MgCl₂，

0.01-0.1％NaN₃，

溶剂为pH6.5-8.0Tris-HCL缓冲液；

所述试剂R2质量组成为：

0.2-3U/mL甘氨胆酸-G6PDH偶联物,

50-1000ug/mL NADP,

0.1-1％BSA

溶剂为pH6.5-8.0Tris-HCL缓冲液。

上述检测方法中，标准曲线的绘制如下：将甘氨胆酸用含体积浓度0.25％牛血清白蛋白的缓冲液稀释成0μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的稀释液，以含所述牛血清白蛋白的缓冲液为空白对照，将所述不同浓度的甘氨胆酸稀释液与试剂R1与混合，25-37℃反应5-10min，然后加入试剂R2，25-37℃反应5-10min，检测340nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀释液中甘氨胆酸浓度作为横坐标制作标准曲线。