一种治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法与流程
本发明涉及一种治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法，属于中药技术领域。
背景技术：
子宫内膜异位症是指具有生长功能的子宫内膜，覆盖于子宫腔以外的身体其他部位，同时出现反复周期性出血的一种妇科疾病。异位内膜在功能上会随着雌激素水平的变化，也会产生明显的变化，不但有内膜的腺体，也有内膜间质的围绕。子宫内膜异位症主要发生在盆腔器官，宫颈、阴道、会阴和腹部切口也可能会出现，有很强的转变和成长能力，为妇科常见病症。内异症多常见于育龄妇女，且其发病率近几年上升趋势较快，其中育龄妇女占到10％以上，且复发率极高。
中医学对“内异症”的诊断治疗是以辨证论治为其根本特色，中医学认为，“内异症”的主证为血瘀证，且贯穿于疾病整个过程。疾病初期以实证为主，病久伤正，因实致虚，少见纯虚证，主表现为虚实夹杂症。属实者，经前痛经，经期疼痛剧烈，拒按。虚实夹杂者，经期痛经，经后痛势稍缓。因寒而瘀者，为冷痛，绞痛，得热痛减；因热致瘀者，为灼痛，得热痛增；因气滞者，胀坠作痛；血瘀甚者，为刺痛。因气滞或寒凝致瘀者，经量少，色紫暗，有血块。因热或湿热而瘀者，经量多，色深红，质稠有血块。气虚血瘀者，经量亦多亦少，色淡黯，质稀夹血块。通过中医对此症的辩证，一般分为气滞血瘀证、寒凝血瘀证、肾虚血瘀证、湿热血瘀证等类型。
中医药在治疗子宫内膜异位症上有其独到的优势，中医药对子宫内膜异位症不仅仅是发挥其治疗作用，同时也能较好的调节机体的内分泌及免疫等多个方面。选用中医药，采取现代优选的提取工艺与制备工艺，制得药品，将为子宫内膜异位症的治疗提供一个确有疗效的中药新品种，为该病患者提供新的治疗药物。因此，对治疗子宫内膜异位症的中药制剂进行检测，控制药品质量，保障用药安全，显得尤为必要。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法，测量结果准确，可有效控制药品质量。
本发明所述治疗子宫内膜异位症的中药制剂为：按重量份数计，由龙血竭53～198份、大黄99～495份、山茱萸198～396份、当归198～396份、牡丹皮198～396份、木香99～330份、延胡索99～330份、赤芍198～396份、茯苓293～495份、莪术173～297份、杠板归105～990份、桂枝99～330份和三棱165～330份制成。其制备方法为：按量称取杠板归、山茱萸、延胡索和大黄药材，加乙醇，回流提取，过滤，得醇提液，备用；按量称取龙血竭、当归、牡丹皮、木香、赤芍、茯苓、莪术、桂枝和三棱，加水，煎煮提取，过滤，得水提液，经减压浓缩，得浓缩水提液，再加入乙醇，搅拌均匀，静置，弃去沉淀，得醇沉上清液，备用；醇提液与醇沉上清液混合，减压浓缩，得浓缩液，浓缩液真空干燥，得浸膏提取物，粉碎过筛，得到药粉，再加入辅料制成各种药物制剂。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法，包括鉴别和含量测定项目；鉴别是对赤芍、牡丹皮、桂枝、木香、山茱萸、莪术、茯苓的薄层色谱鉴别；含量测定是用高效液相色谱法测定制剂中赤芍、杠板归的含量。
前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，桂枝的鉴别方法是以桂皮醛对照品为对照，以沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯＝17:3为展开剂的薄层色谱法；木香的鉴别方法是以去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品为对照，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸＝15:5:1的上层溶液为展开剂的薄层色谱法；山茱萸的鉴别方法是以熊果酸对照品为对照，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:4:0.5为展开剂的薄层色谱法；莪术的鉴别方法是以吉马酮对照品为对照，以沸程为30～60℃的石油醚-丙酮-乙酸乙酯＝94:5:1为展开剂的薄层色谱法；茯苓的鉴别方法是以茯苓对照药材为对照，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:5:0.5为展开剂的薄层色谱法。
进一步地，前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，具体鉴别方法包括下述项目中的至少一项：
(1)桂枝取本制剂或其内容物3g，加乙醇10mL，密塞，浸泡20分钟，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～15μL，对照品溶液2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯＝17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(2)木香 取本制剂或其内容物4g，加甲醇10mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸＝15:5:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)山茱萸 取本制剂或其内容物3g，加乙酸乙酯10mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:4:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；
(4)莪术 取本制剂或其内容物3g，置具塞离心管中，加沸程为30～60℃的石油醚10mL，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取吉马酮对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.4mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为30～60℃的石油醚-丙酮-乙酸乙酯＝94:5:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(5)茯苓 取本制剂或其内容物4g，加乙醚50mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取茯苓对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:5:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸溶液-乙醇＝4:1混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，赤芍的鉴别方法是以芍药苷对照品为对照，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸＝40:5:10:0.2为展开剂的薄层色谱法；牡丹皮的鉴别方法是以丹皮酚对照品为对照，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸＝4:1:0.1为展开剂的薄层色谱法。
进一步地，前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，牡丹皮的鉴别方法具体为：取本制剂或其内容物4g，加乙醚l0mL，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1mL含2mg的溶液作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸＝4:1:0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
进一步地，前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，赤芍的鉴别方法具体为：取本制剂或其内容物3g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸＝40:5:10:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。
前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，赤芍的含量测定方法是以芍药苷对照品为对照，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相的高效液相色谱法；杠板归的含量测定方法是以槲皮素对照品为对照，以甲醇-0.4％磷酸溶液＝50:50为流动相的高效液相色谱法。
进一步地，前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，具体的含量测定方法包括下述项目中的至少一项：
(1)赤芍 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本制剂或其内容物1g，精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂25mL，超声提取10min，取出，过滤，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
(2)杠板归 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液＝50:50为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm；理论板数按槲皮素峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含槲皮素30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取本制剂或其内容物2g，精密称定，至圆底烧瓶中，加入盐酸：甲醇＝1:4的混合溶液50mL，称定重量，置90℃水浴回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
前述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法中，具体地，检测方法包括：
鉴别：(1)取本制剂或其内容物3g，加乙醇10mL，密塞，浸泡20分钟，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～15μL，对照品溶液2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯＝17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(2)取本制剂或其内容物4g，加甲醇10mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸＝15:5:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)取本制剂或其内容物3g，加乙酸乙酯10mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:4:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；
(4)取本制剂或其内容物3g，置具塞离心管中，加沸程为30～60℃的石油醚10mL，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取吉马酮对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.4mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为30～60℃的石油醚-丙酮-乙酸乙酯＝94:5:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(5)取本制剂或其内容物4g，加乙醚50mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取茯苓对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:5:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸溶液-乙醇＝4:1混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；
(6)取本制剂或其内容物4g，加乙醚l0mL，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1mL含2mg的溶液作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸＝4:1:0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(7)取本制剂或其内容物3g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸＝40:5:10:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点；
含量测定：(1)赤芍 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本制剂或其内容物1g，精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，超声提取10min，取出，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
(2)杠板归 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液＝50:50为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm；理论板数按槲皮素峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含槲皮素30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本制剂或其内容物2g，精密称定，至圆底烧瓶中，加入盐酸：甲醇＝1:4的混合溶液50mL，称定重量，置90℃水浴回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
为了确保本发明方案的科学、合理、可行，通过进行一系列试验研究和考察，从而确定本发明的方案。本发明中以治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂为研究对象。
1性状
根据三个批次的中试样品的实验结果拟定：本制剂为黄褐色颗粒；气微，味微苦。
2鉴别
2.1材料
仪器 电子分析天平(METTLER TOLEDO AB204-S)；HH-4数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；YHG-600-S-II型红外快速干燥箱(贺德试器有限公司)；超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；DHG9070A-电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；ZF三用紫外分析仪；薄层层析用硅胶为化学纯，试剂均为分析纯。
试药 芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110736-200526)；丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号110021-200408)；桂皮醛对照品(中国药品生物制品检定所，批号110175-200826)；去氢木香内酯对照品(中国药品生物制品检定所，批号100341-200302)；木香烃内酯对照品(中国药品生物制品检定所，批号110711-200407)；熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110329-200611)；吉马酮对照品(中国药品生物制品检定所，批号110003-200521)；茯苓对照药材(中国药品生物制品检定所，批号100611-200621)；治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂(贵州益佰制药厂中试中心，批号20131001、20131002、20131003)；氯仿、甲醇、甲酸、环己烷、乙酸乙酯、冰醋酸、丙酮、石油醚、乙醇等均为分析纯。
2.2定性检查方法与结果
赤芍的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中赤芍的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图1。
牡丹皮的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中牡丹皮的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图2。
桂枝的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中桂枝的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图3。
木香的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中木香的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图4。
山茱萸的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中山茱萸的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图5。
莪术的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中莪术的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图6。
茯苓的薄层鉴别方法 本实验参照《中国药典》2010版一部中茯苓的薄层色谱鉴别方法，经多次试验，方法灵敏，重复性及专属性好，方便可行，阴性无干扰，结果见图7。
3检查
参照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录I C颗粒剂项下的规定，对本制剂的粒度、水分、溶化性、装量差异、微生物限度等进行了考察。
3.1粒度检查
粒度测定法参照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录XI B第二发测定。取本颗粒剂10袋，称定重量，置规定的药筛内过筛，保持水平状态，左右往返轻轻筛动3～5min。取不能通过一号筛和能通过五号筛的总和称定重量，计算所占百分比。经检测三批次的样品均小于15％，符合规定。结果见表1。
表1三批次样品粒度检查
3.2装量差异检查
取本颗粒剂10袋，分别称定每袋内容物的重量，每袋装量与标示量相比较，不得超过标示量的±10％，即4.50～5.50g。经测定三批次的样品均符合规定。结果见表2。
表2三批次样品装量差异检查
3.3溶化性
取本颗粒供试品10g，加热水20倍，搅拌5min，立即观察，可溶性颗粒应该全部融化，允许有轻微浑浊，经测定三批次供试品均符合规定。结果见表3。
表3三批次样品溶化性检查
3.4水分检查
水分检查法参照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录IX H第一法测定，取本制剂4g，精密称定，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5h，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30min，精密称定，再在上述温度干燥1h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止，根据减失的重量，计算供试品中含水量。标准规定水分不超过6.0％，经测定三批次样品均小于6.0％，符合规定。结果见表4。
表4三批次样品水分检查
3.5重金属检查
照铅、镉、砷、汞、铜测定法(《中国药典》2010年版一部附录ⅨB)测定。所测数据中铅、砷、铜均未超过2ppm，镉和汞均未超过0.2ppm。结果见表5。
表5重金属及有害元素测定结果表
3.6微生物限度
照微生物限度检查法(《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC)检查，三批样品微生物限度检查，均符合规定。结果见表6。
表6三批样品微生物限度检查结果表
4含量测定
4.1仪器及试药
仪器 Agilent1100高效液相色谱仪、超声波清洗机(HS20500D)、天平(AB204-S)、Buchi旋转蒸发仪、HH-4数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)。
试药芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110736-200526)；槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号100081-200406)；治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂(贵州益佰制药厂中试中心，批号20131001、20131002、20131003)；甲醇(色谱纯与分析纯)；盐酸；磷酸；磷酸二氢钾；娃哈哈纯净水等。
4.2赤芍的含量测定
供试品溶液的制备：
(1)不同提取溶剂的考察
取装量差异项下的颗粒剂1g，精密称定，至50mL锥形瓶中，分别加入甲醇与乙醇的提取溶剂约25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率20HZ)20min，取出，称定重量，用甲醇与乙醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。再分别精密吸取不同溶剂提取的供试品各10μL，按《中国药典》2010年版赤芍项下芍药苷含量测定色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果如图8和图9所示。
结论：考虑到芍药苷的化学性质，参考2010版《中国药典》赤芍中芍药苷测定的供试品处理方法中提取溶剂的基础上考察了以甲醇与乙醇不同溶剂对芍药苷的提取率的影响，在相同条件下，以乙醇为提取溶剂的供试品指标成分峰面积小于以甲醇为提取溶剂供试品指标成分峰面积，且以乙醇为提取溶剂的供试品指标成分峰并未完全分离，说明以乙醇为提取溶剂的供试品中芍药苷没有被完全提取分离，故选择以甲醇溶液作为最佳提取溶剂。
(2)提取方式的考察
①超声提取 取装量差异项下的颗粒剂1g精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率20HZ)20min，取出，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
②回流提取 取装量差异项下的颗粒剂1g精密称定，至50mL圆底烧瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，称定重量。水浴80℃回流提取30min，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
③震摇提取 取装量差异项下的颗粒剂1g精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，震摇20min。过滤，取续滤液，即得。
分别精密吸取超声提取和回流提取的供试品与芍药苷对照品各10μL，按《中国药典》2010年版赤芍项下芍药苷含量测定色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果如图10所示。
结论：由上述色谱图可知超声提取与回流提取、震摇提取色谱图中芍药苷峰面积无较大变化，说明上述三种提取方法均能提取出芍药苷，考虑到现代实验室仪器的普及率和节约成本、时间，故选用超声提取方法。
(3)超声时间考察
取装量差异项下的颗粒剂1g精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL。称定重量，分别超声处理(功率250W，频率20HZ)10min、20min、30min，取出，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
分别精密吸取超声提取10、20、30min的供试品各10μL，按《中国药典》2010年版赤芍项下芍药苷含量测定色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果如图11所示。
结论：由上述色谱图可知超声时间10、20、30min芍药苷峰面积无较大变化。因此为了节约时间和功耗，选用超声10min的方法。
综上所述，供试品溶液的制备方法为：取装量差异项下的颗粒剂1g精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率20HZ)10min，取出，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
色谱条件优选：
(1)色谱柱优选
本发明分别用DIKMA柱，agela柱、Agilent柱进行分析，比较分离结果，三种色谱柱相比较，峰形有一定差异，且保留时间差异较大，agela柱的峰形较好，分离效果agela柱比DIKMA柱、Agilent柱好，故确定agela柱作为含量测定分析柱。结果见图12。
(2)色谱波长优选
在进行芍药苷含量测定色谱条件选择时，参考了《中华人民共和国药典》2010年版一部赤芍项下芍药苷的含量测定色谱条件，进行了色谱波长的筛选。分别比较了220nm、230nm、235nm、240nm等波长下芍药苷的分离度、理论塔板数和其峰面积，结果证明在波长230nm处，芍药苷的分离度最好，峰面积最大，干扰因素最小。结果见图13。
(3)色谱柱温优选
本发明比较了25℃、30℃、35℃的柱温对芍药苷的影响，实验结果表明柱温的改变也改变了芍药苷的保留时间，而在25℃柱温条件下，芍药苷峰分离度最好，理论塔板数高。结果见图14。
(4)流动相优选
本发明参考了《中国药典》2010年版一部赤芍项下芍药苷的含量测定的色谱条件，比较了乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65、甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝35:70、甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65和甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝45:60的流动相，得出芍药苷在甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65的流动相下分离度最好，理论塔板数最高。结果见图15。
综上所述，确定最佳的色谱条件为：以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相，流速1.0mL/min，检测波长为230nm，柱温25℃。
专属性试验：
采用HPLC-阵列二级管检测器，按拟定的色谱条件，分别吸取对照品溶液和供试品溶液进行测定，检测波长为230nm。测定结果表明，供试品溶液中与芍药苷对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰紫外光谱图与对照品紫外光谱图一致，供试品溶液色谱中被测化合物峰纯度在99％以上，说明所确定的色谱条件能对供试品中上述化合物有较好的分离，所建立的方法具有良好的专属性。结果见图16、图17、图18和图19。
线性关系：
精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解制成质量浓度为257μg/mL的对照品溶液，按拟定的色谱条件注入高效液相色谱仪测定。芍药苷进样量分别为1μL、2.5μL、5μL、7.5μL、12.5μL。以峰面积对进样质量进行线性回归，得各被测成分的回归方程、相关系数及线性范围。结果如表7和图20：芍药苷质量浓度在0.26～3.21μg范围呈良好线性关系。
表7
稳定性试验：
照拟定的方法制备制剂供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，按0h，2h，4h，8h，12h分别进样10μL(20131102)，测定芍药苷成分峰面积。结果表明供试品溶液12h内稳定。其RSD为1.80％，符合质量标准技术要求(RSD在3％以内)，稳定性良好。结果见表8。
表8芍药苷稳定性结果
精密度试验：
照拟定的方法制备制剂供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，连续进样6次(20131102)，每次10μL，测定芍药苷成分峰面积，结果6次峰面积RSD为0.78％，符合质量标准技术要求(RSD在3％以内)，精密度良好。结果见表9。
表9芍药苷精密度结果
重复性试验：
取同一批号(20131102)的治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂，照拟定的方法制备制剂供试品溶液6份，以拟定的色谱条件，每次10μL，分别测定芍药苷成分峰面积，计算指标含量，RSD为2.03％，符合质量标准技术要求(RSD均在3％以内)，重复性良好。结果见表10。
表10芍药苷重现性结果
回收率试验：
采用加样回收率法，取治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂样品(20131102)9份，每份0.5g，精密称定，按拟定的方法对样品进行处理，加入适量芍药苷对照品溶液，制成低、中、高3种不同浓度供试品溶液。按拟定的色谱条件，进行测定，按下式计算出回收率，计算式如下：
回收率＝(C-A)/B×100％
A：样品中含对应对照品的量(mg)
B：对照品加入量(mg)
C：测得量(mg)
表11芍药苷加样回收结果
结果如表11所示：该样品的平均回收率为99.29％，RSD为1.73％，准确度良好。
4.3杠板归的含量测定
供试品溶液的制备：
(1)不同提取溶剂的考察
取装量差异项下的颗粒剂2g精密称定，至100mL圆底烧瓶中，分别加入盐酸:甲醇(v:v)＝1:4与盐酸:乙醇(v:v)＝1:4的提取溶剂约50mL，称定重量。水浴90℃回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。再分别精密吸取不同溶剂提取的供试品与槲皮素对照品各10μL，按《中国药典》2010年版杠板归项下槲皮素含量测定色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果如图21和图22所示。
结论：考虑到槲皮素的化学性质，参考2010版《中国药典》杠板归中槲皮素测定的供试品处理方法中提取溶剂的基础上考察了以盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的混合溶液与盐酸:乙醇(v:v)＝1:4的混合溶液不同溶剂对槲皮素的提取率的影响，在相同条件下，以盐酸:乙醇(v:v)＝1:4的混合溶液为提取溶剂的供试品峰面积小于以盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的混合溶液为提取溶剂供试品峰面积(峰面积比为362:175)，说明以盐酸:乙醇(v:v)＝1:4的混合溶液为提取溶剂的供试品中槲皮素没有被完全提取，故选择以盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的混合溶液作为最佳提取溶剂。
(2)不同提取方式的考察
①超声提取 取装量差异项下的颗粒剂2g精密称定，至100mL容量瓶中，加入盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的混合溶液约50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率20HZ)30min，取出，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
②回流提取 取装量差异项下的颗粒剂2g精密称定，至100mL圆底烧瓶中，加入盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的提取溶剂约50mL，称定重量。水浴90℃回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
分别精密吸取超声提取和回流提取的供试品与槲皮素对照品各10μL，按《中国药典》2010年版杠板归项下槲皮素含量测定色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果如图23所示。
结论：由上述色谱图可知超声提取色谱图并无槲皮素峰出现，说明超声方法没有提取出槲皮素，因此选用回流提取方法。
(3)回流提取时间考察
取装量差异项下的颗粒剂2g精密称定，至100mL圆底烧瓶中，加入盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的提取溶剂约50mL，称定重量。分别水浴90℃回流提取0.5h、1h、1.5h，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。
分别精密吸取回流提取0.5h、1h、1.5h的供试品与槲皮素对照品各10μL，按《中国药典》2010年版杠板归项下槲皮素含量测定色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，即得。结果如图24所示。
结论：由上述色谱图可知提取时间为0.5小时槲皮素峰面积小于提取时间1小时和1.5小时的槲皮素峰面积，而提取时间1小时和1.5小时的槲皮素峰面积有一定相差，提取时间为1.5小时的槲皮素峰面积约小于提取时间1小时的槲皮素峰面积，这说明提取1小时后槲皮素已经提取完全，且时间太长反而照成槲皮素的损失。因此为了节约时间和功耗，选用提取1小时的方法。
综上所述，供试品溶液的制备方法为：取装量差异项下的颗粒剂2g精密称定，至100mL圆底烧瓶中，加入盐酸:甲醇(v:v)＝1:4的提取溶剂约50mL，称定重量。分别水浴90℃回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，即得。色谱条件优选：
(1)色谱柱优选
本发明分别用DIKMA柱，Agela柱Agilent柱进行分析，比较分离结果，三种色谱柱相比较，峰形有一定差异，且保留时间差异较大，Agela柱的峰形较好，分离效果Agela柱比DIKMA柱、Agilent柱好，故确定Agela柱作为含量测定分析柱。结果如图25所示。
(2)色谱波长优选
在进行槲皮素含量测定色谱条件选择时，参考了《中华人民共和国药典》2010年版一部杠板归项下槲皮素的含量测定色谱条件，进行了色谱波长的筛选。分别比较了340nm、350nm、355nm、360nm等波长下槲皮素的分离度、理论塔板数和其峰面积，结果证明在波长360nm处，槲皮素的分离度最好，峰面积最大，干扰因素最小。结果如图26所示。
(3)色谱柱温优选
本发明比较了25℃、30℃、35℃的柱温对槲皮素的影响，实验结果表明30℃柱温条件下，分离度最好，保留时间短，理论塔板数高。结果如图27所示。
(4)流动相优选
本发明参考了《中华人民共和国药典》2010年版一部杠板归项下槲皮素的含量测定的色谱条件，比较了按照体积比，甲醇-0.4％磷酸水＝55:45、甲醇-0.4％磷酸水＝50:50、甲醇-0.4％磷酸水＝45:55以及乙腈-0.4％磷酸水＝50:50的流动相，得出槲皮素在甲醇-0.4％磷酸水＝50:50的流动相下分离度最好，故确定流动相为甲醇-0.4％磷酸水＝50:50。结果如图28所示。
综上所述，确定最佳的色谱条件为：甲醇-0.4％磷酸水＝50:50为流动相，流速1.0mL/min，检测波长为360nm，柱温30℃。
专属性试验：
采用HPLC-阵列二级管检测器，按拟定的色谱条件，分别吸取对照品溶液和供试品溶液进行测定，检测波长为360nm。测定结果表明，供试品溶液中与槲皮素对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰紫外光谱图与对照品紫外光谱图一致，供试品溶液色谱中被测化合物峰纯度在99％以上，说明所确定的色谱条件能对供试品中上述化合物有较好的分离，所建立的方法具有良好的专属性。结果如图29、图30、图31和图32所示。
线性关系：
精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解制成质量浓度为90μg/mL的对照品溶液，按拟定的色谱条件注入高效液相色谱仪测定。槲皮素进样量分别为0.1μL、0.3μL、0.5μL、1μL、2μL。以峰面积对进样质量进行线性回归，得被测成分的回归方程、相关系数及线性范围。结果如表12和图33所示：槲皮素质量浓度在0.009～0.180μg范围呈良好线性关系。
表12
稳定性试验：
照拟定的方法制备制剂供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，按0h，2h，4h，8h，12h分别进样10μL(20131102)，测定槲皮素成分峰面积。结果表明供试品溶液12h内稳定。其RSD为1.60％，符合质量标准技术要求(RSD在3％以内)，稳定性良好。结果见表13。
表13槲皮素稳定性结果
精密度试验：
照拟定的方法制备制剂供试品溶液1份，以拟定的色谱条件，连续进样6次(20131102)，每次10μL，测定槲皮素成分峰面积，结果6次峰面积RSD为0.82％，符合质量标准技术要求(RSD在3％以内)，精密度良好。结果见表14。
表14槲皮素精密度结果
重复性试验：
取同一批号(20131102)的治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂，照拟定的方法分别制备制剂供试品溶液6份，以拟定的色谱条件，每次10μL，分别测定槲皮素成分峰面积，计算指标含量，RSD为1.81％，符合质量标准技术要求(RSD均在3％以内)，重复性良好。结果见表15。
表15槲皮素重现性结果
回收率试验：
采用加样回收率法，取治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂样品(20131102)9份，每份1g，精密称定，按拟定的样品溶液制备方法对样品进行处理，加入适量槲皮素对照品溶液，制成低、中、高3种不同浓度供试品溶液。按拟定的色谱条件进行测定，按下式计算出回收率，计算式如下：
回收率＝(C-A)/B×100％
A：样品中含对应对照品的量(mg)
B：对照品加入量(mg)
C：测得量(mg)
表16加样回收结果
结果如表16所示：该样品的平均回收率为99.88％，RSD为2.19％，准确度良好。
4.4含量测定结果
分别取3个批次的治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂，按供试品溶液制备方法及拟定的色谱条件，测定槲皮素及芍药苷成分的含量，测定结果见表17。
表17治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂含量测定结果(mg/g)
上述3批样品测得槲皮素与芍药苷平均含量分别为0.1258mg/g和2.9475mg/g。从大批量规模生产考虑，以本制剂每克槲皮素与芍药苷的含量限度平均含量的80％计算，即槲皮素0.1258×5×0.8＝0.504mg/袋，芍药苷2.9475×5×0.8＝11.79mg/袋，初步规定本制剂每袋(5g)含赤芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于11.8mg；本制剂每袋含杠板归以槲皮素(C15H10O7)计，不得少于0.5mg。
本发明的有益之处在于：本发明的检测方法通过对制剂中桂枝、赤芍、木香、牡丹皮、山茱萸、茯苓、莪术七位药材进行鉴别，所得结果阴性无干扰，且专属性较强，与对照品或对照药材相应的位置显相同颜色的斑点；对该制剂中槲皮素及芍药苷含量测定，精密度、稳定性、重现性、系统适应性及加样回收率均符合要求。本制剂的检测方法简便、快速、可靠、准确，专属性强，精密度高，重现性好，回收率高，测量结果准确，可有效控制药品质量，从而确保产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。
附图说明
图1是赤芍薄层鉴别图；
图2是牡丹皮薄层鉴别图；
图3是桂枝薄层鉴别图；
图4是木香薄层鉴别图；
图5是山茱萸薄层鉴别图；
图6是莪术薄层鉴别图；
图7是茯苓薄层鉴别图；
图8是赤芍的含量测定中不同溶剂提取对照色谱图；
图9是赤芍的含量测定中芍药苷对照品色谱图；
图10是赤芍的含量测定中提取方法对比色谱图；
图11是赤芍的含量测定中超声时间对比色谱图；
图12是赤芍的含量测定中不同色谱柱对比色谱图；
图13是赤芍的含量测定中不同波长对比色谱图；
图14是赤芍的含量测定中不同柱温对比色谱图；
图15是赤芍的含量测定中不同流动相对比色谱图；
图16是赤芍的含量测定中治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂样品色谱图；
图17是赤芍的含量测定中芍药苷对照品色谱图；
图18是赤芍的含量测定中缺赤芍阴性样品色谱图；
图19是赤芍的含量测定中溶剂色谱图；
图20是赤芍的含量测定中芍药苷标准曲线图；
图21是杠板归的含量测定中不同溶剂提取对照色谱图；
图22是杠板归的含量测定中槲皮素对照品色谱图；
图23是杠板归的含量测定中提取方法对比色谱图；
图24是杠板归的含量测定中提取时间对比色谱图；
图25是杠板归的含量测定中不同色谱柱对比色谱图；
图26是杠板归的含量测定中不同波长对比色谱图；
图27是杠板归的含量测定中不同柱温对比色谱图；
图28是杠板归的含量测定中不同流动相对比色谱图；
图29是杠板归的含量测定中治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂样品色谱图；
图30是杠板归的含量测定中槲皮素对照品色谱图；
图31是杠板归的含量测定中缺杠板归阴性样品色谱图；
图32是杠板归的含量测定中溶剂色谱图；
图33是杠板归的含量测定中槲皮素标准曲线图；
图中附图标记的含义：图1中：1为芍药苷对照品，2为缺赤芍阴性对照，3、4、5分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003；图2中：1为缺牡丹皮阴性对照，2为丹皮酚对照品，3、4、5分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003；图3中：1为桂皮醛对照品，2为缺桂枝阴性对照，3、4、5分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003；图4中：1为缺木香阴性对照，2为去氢木香内酯对照品，3为木香烃内酯对照品，4、5、6分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003；图5中：1为熊果酸对照品，2为缺山茱萸阴性对照，3、4、5分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003；图6中：1为吉马酮对照品，2为缺莪术阴性对照，3、4、5分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003；图7中：1为茯苓对照药材，2为缺茯苓阴性对照，3、4、5分别为治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂供试品20131001、20131002、20131003。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1治疗子宫内膜异位症的中药制剂中桂枝的鉴别：
桂枝的鉴别方法是以桂皮醛对照品为对照，以沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯＝17:3为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物3g，加乙醇10mL，密塞，浸泡20分钟，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～15μL，对照品溶液2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯＝17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例2治疗子宫内膜异位症的中药制剂中木香的鉴别：
木香的鉴别方法是以去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品为对照，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸＝15:5:1的上层溶液为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物4g，加甲醇10mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸＝15:5:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例3治疗子宫内膜异位症的中药制剂中山茱萸的鉴别：
山茱萸的鉴别方法是以熊果酸对照品为对照，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:4:0.5为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物3g，加乙酸乙酯10mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:4:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。
实施例4治疗子宫内膜异位症的中药制剂中莪术的鉴别：
莪术的鉴别方法是以吉马酮对照品为对照，以沸程为30～60℃的石油醚-丙酮-乙酸乙酯＝94:5:1为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物3g，置具塞离心管中，加沸程为30～60℃的石油醚10mL，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取吉马酮对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.4mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为30～60℃的石油醚-丙酮-乙酸乙酯＝94:5:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例5治疗子宫内膜异位症的中药制剂中茯苓的鉴别：
茯苓的鉴别方法是以茯苓对照药材为对照，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:5:0.5为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物4g，加乙醚50mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取茯苓对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:5:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸溶液-乙醇＝4:1混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
实施例6治疗子宫内膜异位症的中药制剂中牡丹皮的鉴别：
牡丹皮的鉴别方法是以丹皮酚对照品为对照，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸＝4:1:0.1为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物4g，加乙醚l0mL，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1mL含2mg的溶液作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸＝4:1:0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸乙醇溶液(1→l0)，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例7治疗子宫内膜异位症的中药制剂中赤芍的鉴别：
赤芍的鉴别方法是以芍药苷对照品为对照，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸＝40:5:10:0.2为展开剂的薄层色谱法，具体为：取本制剂或其内容物3g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸＝40:5:10:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。
实施例8治疗子宫内膜异位症的中药制剂中赤芍的含量测定：
赤芍含量测定方法是以芍药苷对照品为对照，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相的高效液相色谱法，具体的含量测定方法为：
赤芍 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本制剂或其内容物1g，精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，超声提取10min，取出，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例9治疗子宫内膜异位症的中药制剂中杠板归的含量测定：
杠板归含量测定方法是以槲皮素对照品为对照，以甲醇-0.4％磷酸溶液＝50:50为流动相的高效液相色谱法，具体的含量测定方法为：
杠板归 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液＝50:50为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm；理论板数按槲皮素峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含槲皮素30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本制剂或其内容物2g，精密称定，至圆底烧瓶中，加入盐酸:甲醇＝1:4的混合溶液50mL，称定重量，置90℃水浴回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述治疗子宫内膜异位症的中药制剂的检测方法包括鉴别和含量测定项目，其中鉴别至少包括实施例1～实施例5中任意一项，含量测定至少包括实施例8～实施例9中任意一项。
实施例10治疗子宫内膜异位症的中药颗粒剂的检测方法包括：
性状：本制剂为黄褐色颗粒；气微，味微苦；
鉴别：
(1)取本制剂3g，加乙醇10mL，密塞，浸泡20分钟，时时振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～15μL，对照品溶液2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯＝17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(2)取本制剂4g，加甲醇10mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸＝15:5:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)取本制剂3g，加乙酸乙酯10mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:4:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；
(4)取本制剂3g，置具塞离心管中，加沸程为30～60℃的石油醚10mL，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取吉马酮对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.4mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸程为30～60℃的石油醚-丙酮-乙酸乙酯＝94:5:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(5)取本制剂4g，加乙醚50mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取茯苓对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸＝20:5:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸溶液-乙醇＝4:1混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；
(6)取本制剂4g，加乙醚l0mL，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1mL含2mg的溶液作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸＝4:1:0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸乙醇溶液(1→l0)，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(7)取本制剂3g，加乙醇10mL，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸＝40:5:10:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点；
检查：应符合中国药典2010年版一部附录I C颗粒剂项下有关的各项规定；
含量测定：(1)赤芍 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝40:65为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本制剂1g，精密称定，至50mL锥形瓶中，加入甲醇提取溶剂约25mL，超声提取10min，取出，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本颗粒剂每袋含赤芍以芍药苷计，不得少于11.8mg。
(2)杠板归 照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液＝50:50为流动相；流速为1mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm；理论板数按槲皮素峰计应不低于3000；
对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含槲皮素30μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本制剂2g，精密称定，至圆底烧瓶中，加入盐酸：甲醇＝1:4的混合溶液50mL，称定重量，置90℃水浴回流提取1小时，取出，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本颗粒剂每袋含杠板归以槲皮素计，不得少于0.5mg。
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