本发明属于微生物分离检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种外源性禽白血病病毒的检测方法。
背景技术：
禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的多种肿瘤性疾病的总称。ALV可感染各类鸡群，有垂直传播、水平传播以及昆虫、针头、疫苗污染等传播方式，其中垂直传播为主要感染方式。目前尚无有效疫苗可防控此病，也无有效的药物治疗方法，只能通过净化措施切断种鸡场的ALV传染源，从源头上控制此病。
目前国内外主要通过检测胎粪、泄殖腔拭子、蛋清以及病毒分离等手段进行禽白血病净化。利用鸡胚成纤维细胞系(DF1细胞)进行病毒分离的方式可区分内/外源性禽白血病病毒，该方法也是目前最为有效的净化方法。现有病毒分离方法(传统方法)的主要操作步骤如下：1)将生长良好的DF1细胞传代于细胞培养瓶或者培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养至DF1细胞生长至70-80％单层；2)无菌采集鸡抗凝血，离心取血浆，将血浆适量接种到生长到70-80％单层的DF1细胞中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，换成含1％胎牛血清的维持液，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养；3)将步骤2中的培养物培养至7-8天后，将培养物冻融，然后按ELISA试剂盒说明书检测P27抗原。
然而，传统病毒分离方法中，待DF1细胞生长至70-80％单层才接种血浆，此时的细胞状态良好、非常稳定，增加了病毒侵入细胞的难度。病毒未完全参与DF1细胞的贴壁、生长以及分裂过程，且在接种后仅孵育了2小时就换液了，部分病毒未侵入细胞而不能繁殖，导致检出P27抗原的阳性率较低。此外，传统病毒分离方法操作复杂，需培养单层细胞和孵育等步骤，技术难于掌握。
技术实现要素：
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的外源性禽白血病病毒的检测方法。该方法能够更准确、更灵敏地检测出鸡抗凝血中的外源性ALV。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种外源性禽白血病病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)、将生长良好的DF1细胞进行消化、用含10％胎牛血清的DMEM培养液稀释至细胞密度为(1-1.04)×105个/ml，传代于24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养25-35min，至细胞培养板底部沉积45-55％的细胞时，向细胞培养板的每孔依次贴壁加入待检测鸡的血浆，培养过夜；
(2)、弃掉细胞培养板中原液，每孔加入含1％胎牛血清的DMEM维持液，继续培养7-8天，将培养物置于-20℃冻存；
(3)、将步骤(2)的培养物解冻，轻轻吹打混匀，先分别吸取150ul培养物于96孔备样板中，再用12道移液枪吸取100ul培养物加至P27抗原反应板中，按ELISA试剂盒(IDEXX)的说明书检测P27抗原，判定待检测鸡是否感染外源性禽白血病病毒。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述稀释后的细胞传代培养30-35min，至细胞培养板底部沉积50-55％的细胞，加入待检测鸡的血浆。
在其中一些实施例中，步骤(1)中每孔加入的待检测鸡血浆体积与细胞培养板中培养物的体积比为1:20。
在其中一些实施例中，步骤(1)和(2)中所述培养箱中的条件为：37℃、5％CO2。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述待检测鸡的血浆的制备方法为：将无菌采集待检测鸡的全血，贴壁加入到质量百分比为1‰的肝素钠抗凝剂中，冷冻离心，得到血浆。
在其中一些实施例中，上述冷冻离心条件为4℃，10000rpm，离心25s。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述培养物加入到P27抗原反应板的方法为：先分别吸取150ul培养物于96孔备样板中，再用12道移液枪吸取100ul加至P27抗原反应板中。
与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
1、本发明检测外源性禽白血病病毒的方法是将生长良好的DF1细胞按适宜的浓度传代到细胞培养板中，仅培养25-35min就接种血浆，隔日才换成含1％胎牛血清的维持液，病毒参与了DF1细胞的贴壁、生长以及分裂过程。相比传统方法，本发明方法对同一批样品能检测出更高的阳性率，检测出的S/P均值更高(差异极显著，P﹤0.01)；且具有同等的稳定性、准确性，以及更高的灵敏性；
2、本发明的检测外源性禽白血病病毒的方法将150ul冻融的培养物先加入到96孔备样板中，然后用12道移液枪吸取100ul加到P27抗原反应板中，此操作缩短了样品加入到P27抗原反应板的时间，保证了不同样品反应时间的一致性。
附图说明
图1为对采用本发明实施例1方法与传统方法的P27抗原S/P值进行相关性分析的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1外源性禽白血病病毒的检测方法
用标准毒株ALV-J NX0101株(毒株由华南农业大学家禽研究室赠送)感染某1日龄黄羽种鸡61只，随机分成2组，第一组30只，第二组31只，按种鸡饲养标准进行饲养。在第6周采集第一组鸡的抗凝血、第8周采集第二组鸡的抗凝血，分别用传统方法及本实施例方法进行病毒检测。包括以下步骤：
1、鸡抗凝血的采集与处理
(1)、准备浓度为1‰的肝素钠抗凝剂：将0.5g肝素钠粉末加入500ml双蒸水中溶解，121℃高压30min，冷却。
(2)、将抗凝剂分装到已高压的1.5ml离心管中，100ul/管，并置于采样盒中，96管/盒(编号:1-96)，置于4℃冰箱备用。
(3)、保温采样袋或泡沫箱：将采样盒放入采样袋中，同时放入数个冰袋以保持低温(冰袋越多越好)。
(4)、无菌采血：用2ml无菌注射器，每只鸡采集0.7ml以上的全血，拔掉针头(必须拔掉针头，以免溶血)，贴壁加入到已加抗凝剂的离心管中，摇匀。同时记录鸡的翅号、离心管号及盒号(必须一一对应)。将采好的血放入低温采样袋中，送至实验室。
(5)、离心：将含有抗凝血离心管置于台式冷冻离心机中，4℃，10000rpm，离心25s。
(6)、分离血浆：用已高压灭菌的枪头，按顺序吸取150ul血浆于96孔细胞板中，做好记录。
2、准备DF1细胞及接种
(1)、将生长良好的DF1细胞进行消化、用含10％胎牛血清的DMEM培养液稀释至细胞密度为(1-1.04)×105个/ml，传代于24孔细胞培养板中(每孔1ml)，37℃、5％CO2培养。
(2)、待上述步骤中的细胞培养25-35min，至细胞培养板底部沉积45-55％左右的细胞时，向细胞培养板中每孔依次贴壁加入50ul待检测鸡的血浆，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
以传统方法(提前1天将生长良好的DF1细胞传代于24孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞生长至70-80％单层，向24孔细胞培养板中每孔依次贴壁加入50ul血浆，37℃、5％CO2培养箱中培养)作为对照。
3、换液
接待检测鸡的血浆之后培养过夜，次日换液。弃掉细胞板中原液，加入含1％胎牛血清的DMEM维持液，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养7-8天将培养物置于-20℃冰箱冻存。此期间每日观察，做好记录(必须保证培养8天后细胞仍不死亡)。
以传统方法(接待检测鸡的血浆之后置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，换成含1％胎牛血清的DMEM维持液，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养7-8天)作为对照。
4、ALV-J P27抗原的检测
将上述步骤3的培养物解冻，轻轻吹打混匀，分别吸取150ul于96孔备样板中，然后用12道移液枪吸取100ul加到P27抗原反应板中，按ELISA试剂盒(IDEXX)的说明书检测P27抗原，用酶标仪读取数据并判定结果。当样品的S/P值大于0.2时，即判定该样品为阳性。
5、结果
第一组第6周采血经病毒分离后P27抗原的检测结果如表1所示。
表1第一组第6周采血经病毒分离后P27抗原的检测结果
如表1所示，30只1日龄黄羽种鸡感染ALV-J 6周后，采集的抗凝血分别用传统方法和本发明方法进行病毒分离，经ALV-J P27抗原的检测。本发明方法检测出的P27抗原阳性率为80.00％(24/30),传统方法检测出的阳性率仅66.67％(20/30)。
第二组第8周采血经病毒分离后P27抗原的检测结果如表2所示。
表2第二组第8周采血经病毒分离后P27抗原的检测结果
如表2所示，本发明实施例1的方法检测出的P27抗原阳性率为67.74％(21/31)，传统方法检测出的阳性率只有61.29％(19/31)。
综上重复试验结果表明，对同一批样品，用本发明实施例1的方法检测出的阳性率比传统方法检测出的阳性率高。
试验例1本发明实施例1与传统的检测方法检测P27抗原S/P值的相关性分析
利用JMP8软件，对本发明实施例1的检测方法与传统的检测方法检测P27抗原的S/P值进行相关性分析，结果如图1所示。
图1结果表明，本发明实施例1的方法S/P均值(1.70710)高于传统方法S/P均值(1.11072)，且差异极显著(P＝0.0073﹤0.01)，即本发明实施例1的方法比传统方法更灵敏。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。