腮腺炎病毒HN抗原及其在检测抗腮腺炎病毒抗体中的用途的制作方法

本发明涉及抗体的免疫检测领域，特别是抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体的免疫检测领域。

背景技术：

腮腺炎是由腮腺炎病毒(Mumps virus，MV)引起的急性传染病。腮腺炎病毒的传播通常是以空气飞沫为载体，这也导致了该病的高传播率。通常情况下，感染腮腺炎病毒后出现明显临床症状的可能性约为60%，出现包括发热、食欲不振、头痛、全身不适等症状，随后出现的双侧或单侧的腮腺肿大具有诊断意义。腮腺炎作为以腮腺肿大为特征的急性呼吸道传染病，多发于儿童和青年，脑炎、脑膜炎、睾丸炎等并发症是其主要危害。在感染发病人群中，有5%的青年女性可发生卵巢炎，20%的青年男性可发生单侧睾丸炎。在总的感染发病者中，并发无菌性脑膜炎的可达15%，并发胰腺炎的约有5%，并发脑炎的可能性约为1/6000，并发单侧永久性耳聋的可能比例为1/15000，这也使腮腺炎受到了广泛的关注。

腮腺炎病毒属副粘液病毒科，直径为90nm ~ 600nm , 平均为140nm , 是不分节的单股负链核糖核酸(RNA)基因, 基因组的顺序为：3’N-NS1/ P-M-F-SH-HN- L5’。腮腺炎病毒单负链基因组RNA依次编码7种蛋白：核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、小疏水蛋白(SH)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和大蛋白(L)。本发明人经过对腮腺炎病毒经过分子生物学分析，预期腮腺炎病毒颗粒中具有主要抗原作用的蛋白成分是其外膜上突起状的血凝素神经氨酸酶HN蛋白。

腮腺炎疫苗于2008年已纳入国家免疫规划，我国普遍使用的疫苗是上海生物制品研究所建立的S79株腮腺炎病毒株制造疫苗，该毒株的病毒滴度较高、免疫原性较好且临床反应轻，经过试验证明各地使用后的抗体阳转率达82.6%～88.6%。利用蚀斑纯化技术对毒株进行筛选后，得到纯化的制备疫苗，其与未纯化的病毒疫苗及进口的MMR联合疫苗同时进行免疫原性观察，结果发现纯化病毒疫苗的抗体阳转率得到提高至83.33%～94.29%。虽然随着腮腺炎疫苗的使用腮腺炎的发病率大大降低，但近年来发现腮腺炎的发病率呈上升趋势，甚至有局部爆发的情况，这种高发局势使人们越来越关注腮腺炎疫苗的免疫效果。

国内关于腮腺炎方面的研究往往限于疫苗的研制和开发过程，而缺乏大范围人群正式使用后的评估。只有从病人及人群进行研究才能更好地对疫苗免疫效果进行评估，并且经临床试验证明有效的疫苗应继续进行上市后大规模人群应用后的研究，这样能得到真实的保护效果状况。随着接种腮腺炎疫苗人数的增加，现在迫切需要一种快速、简便同时具有高灵敏度、高特异性优点的检测抗腮腺炎病毒抗体的方法，以此来判断接种疫苗后个体对腮腺炎病毒的敏感度以及对疫苗的免疫应答状况。

目前针对腮腺炎的疫苗效力试验以及流行病调查方法主要酶联检测法、免疫中和试验、血凝抑制(HI)、补体结合等。免疫中和试验(SN)法是最敏感和特异性高的经典方法，但操作复杂，费时费力。

由于ELISA操作简单、快速，并且可进行大批量检测，因此它是目前使用最为广泛的方法。ELISA检测特异性抗体水平应用广，ELISA间接法具有方法简单、准确度高、无需特殊仪器等特点，通过包被纯度表位抗原，以WHO腮腺炎血清抗体参考品为标准品，可以建立了定量检测抗腮腺炎病毒中和抗体的ELISA方法。但目前市售的ELISA试剂盒采用的是全病毒抗原包被，因此敏感性较差。目前认为腮腺炎只有一个血清型，病后可以产生持久的免疫力。血清学方法检测腮腺炎抗体对于易感人群的确定和鉴别、腮腺炎疫苗免疫策略的研究以及疫苗免疫效果的评价具有重要意义。

技术实现要素：

本发明经过对腮腺炎病毒基因组以及表达蛋白进行分析找到了能够特异性检测抗腮腺炎病毒抗体的HN抗原，并且基于所发现的HN抗原可以实现特异性检测人血中抗腮腺炎病毒抗体。

具体而言，在本发明的一个方面中，涉及检测抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体的腮腺炎病毒HN抗原，其中所述抗原选自如下氨基酸序列中的一种或一种以上：a. SEQ ID NO.1所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.1所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列的序列；b. SEQ ID NO.2所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.2所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列的序列；c. SEQ ID NO.3所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.3具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.3所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.3具有80%以上相似性的序列的序列；d. SEQ ID NO.4所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.4具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.4所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.4具有80%以上相似性的序列的序列。

在本发明的另一个方面中，涉及上述腮腺炎病毒HN抗原在检测抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体中的用途。在该方面的一些实施方案中使用上述腮腺炎病毒HN抗原通过免疫检测方法检测所述抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体，免疫检测方法例如酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法、胶体金法、乳胶法以及其它方法，并且其中酶联免疫法例如酶联免疫吸附测定法，荧光免疫法例如时间分辨荧光免疫法。

在本发明的再一个方面中，涉及测定抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体的试剂盒，所述试剂盒包括检测抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体的腮腺炎病毒HN抗原，其中所述抗原选自如下氨基酸序列中的一种或一种以上：a. SEQ ID NO.1所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.1所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列的序列；b. SEQ ID NO.2所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.2所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列的序列；c. SEQ ID NO.3所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.3具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.3所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.3具有80%以上相似性的序列的序列；d. SEQ ID NO.4所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.4具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.4所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.4具有80%以上相似性的序列的序列。除此之外，试剂盒还包括免疫诊断方法例如酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法、胶体金法或乳胶法等通常所使用的其它试剂。所述的这些试剂例如是检测人IgG、IgM或者IgA的试剂，诸如羊或兔抗人IgG、IgM或IgA的抗体等。

附图说明

图1是描述腮腺炎病毒HN序列抗原性分析的图。

图2显示4种腮腺炎病毒HN抗原纯化后的SDS-PAGE图。

具体实施方式

腮腺炎病毒HN蛋白是病毒感染细胞的关键抗原，该蛋白基因的变异可以引起病毒抗原性的变化。研究表明HN基因含1749个核苷酸，编码582aa，分为4段片段，分别为：HN1：1-80aa ；HN2：81-212aa ；HN3：213-372aa ；HN4：373-582aa。其中抗原表位位于213-372aa和352-360aa，核心抗原表位为329-340aa。HN蛋白为病毒主要结构抗原，特点为保守性高，分析不同株的同源性发现，不同分离株之间的差异性较低为0～2.3％。而流行株和疫苗株的差异性为4.2～5.3%，主要在HN蛋白基因354位：流行株为Q，疫苗株为P以及第356位：流行株为D，疫苗株为E。基于此，本发明人认为HN蛋白可能是潜在的腮腺炎病毒抗体检测用抗原。

腮腺炎病毒中和抗体的检测多以病毒中和试验为金标准，这是敏感而特异的血清学方法，其检测的抗体能与病毒颗粒上的表面抗原，特别是与吸附于宿主细胞上的病毒表面抗原对应，因此可直接评价机体保护力(中和病毒感染力)。但该检测过程中使用具有强传染能力的腮腺炎病毒，具有极大的危险性。因此本领域急需一种不使用腮腺炎病毒的检测抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体的安全有效的方法。

为了实现对接种腮腺炎疫苗后人群中是否产生抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体进行安全有效的检测，本发明人基于上述HN的特点确定尝试使用HN蛋白抗原对腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体进行检测。首先本发明人对HN的抗原表位进行了生物信息学研究，找到了4段可能的高抗原性的抗原片段，即SEQ ID NO.1、2、3或4所示序列，并对该4段HN抗原进行了克隆表达，并且基于间接酶联免疫技术使用腮腺炎疫苗接种者血清对4种纯化后的抗原片段的抗原特异性和灵敏度进行检验，结果发现所选择的片段2、3均能特异性地检测接种腮腺炎疫苗后人体内的抗腮腺炎病毒抗体，尤其是中和抗体。

本领域众所周知，与某一个抗原片段具有一定相似性的另一个氨基酸序列片段会具有相同或相似的免疫反应，因此通常认为，通过替换、添加或者缺失某些氨基酸而与本发明的4个HN抗原片段SEQ ID NO.1、2、3或4中的一个片段具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%相似性的序列具有与SEQ ID NO.1、2、3或4相同或者相似的免疫反应，因而这些序列片段可以用于实施本发明的方案中，因此这些序列处于权利要求书要求保护的范围内。

并且本领域亦众所周知，包含SEQ ID NO.1、2、3或4所示序列的序列、或者包含通过氨基酸替换、添加或者缺失而与SEQ ID NO.1、2、3或4中的一个片段具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%相似性的序列的序列同样具有与SEQ ID NO.1、2、3或4相同或者相似的免疫反应，因而这些序列片段也可以用于实施本发明的方案中，因此这些序列也处于权利要求书要求保护的范围内。

由于本发明采用了间接免疫酶联检测技术检测抗腮腺炎病毒中和抗体，有效地避免了在检测过程中使用具有强传染能力的腮腺炎病毒，降低了整个实验的危险性。并且本发明的技术方案还具有简单、易操作、重复性好等特点，容易得到推广和应用。

本领域众所周知，本发明的4个HN抗原片段SEQ ID NO.1、2、3或4可以适用于任何免疫检测方法以检测感染腮腺炎病毒或者接种腮腺炎疫苗后人体内的抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体。这些检测方法包括但不限于例如酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法、胶体金法或乳胶法。其中实施例中使用的间接免疫酶联检测技术属于酶联免疫法中的酶联免疫吸附测定法。再例如，荧光免疫法可以是例如时间分辨荧光免疫法。这些方法均可以用来实施本发明，因此处于权利要求书中要求保护的范围内。

抗体或者中和抗体可以是IgG、IgM或者IgA亚类，因此在使用本发明的HN抗原实现抗腮腺炎病毒抗体、尤其是中和抗体检测的过程中有时会使用到检测人IgG、IgM或者IgA的试剂，这是本领域众所周知的。而所述的这些检测试剂也是本领域众所周知的，例如但不限于诸如羊或兔抗人IgG、IgM或IgA的抗体等。因此在本发明要求保护的试剂盒中，除了本发明的HN抗原片段外还包含这些检测IgG、IgM或者IgA的试剂，以及任选的其他试剂，例如缓冲液等。

下面通过如下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。

实施例1 候选抗原中和表位的选择

本发明人通过生物信息学软件对腮腺炎病毒HN序列进行抗原性预测，结果如图1所示，含有4个主要的抗原区段，其序列分别示于SEQ ID NO.1、2、3和4中。

实施例2 三种腮腺炎病毒HN抗原的克隆、表达与活性鉴定

1．HN抗原基因的设计与合成

为了有利于腮腺炎病毒HN基因在E.coli中获得高效的表达，基于实施例1中确定的4种腮腺炎病毒HN抗原的氨基酸序列，选择大肠杆菌的偏性密码子设计HN基因，并委托上海英潍捷基生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。

2. HN抗原表达质粒的构建与转化

为了便于基因克隆到表达载体中，在两个片段连接臂的两端引入Xho I和Xba I两个酶切位点，以适合表达载体pBVIL1( 参见中国专利ZL00100695.9：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途)，另两个片段连接臂的两端引入BamH I和EcoR I两个酶切位点以适合表达载体PGEX-4T-2。双酶切后分别插入载体pBVIL1和PGEX-4T-2中，构建相应的表达质粒。

2.1 酶切：取以上合成基因产物及pBVIL1、PGEX-4T-2表达载体各82μl分别放于Eeppendorf 离心管中，pBVIL1载体对应片段加入10×buffer(D)10μl、Xba I (10u/μl)和Xho I (12u/μl) 各3μl(PGEX-4T-2载体对应片段加入10×Muti-Core 10μl、BamH I和EcoR I各3μl)，BSA 2μl，置37℃ 水浴酶切过夜。

2.2酶切产物的纯化和回收：基因产物及载体pBVIL1、PGEX-4T-2经双酶切后，按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)中所述的方法进行用2%琼脂糖凝胶进行分离，并用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒进行纯化回收。即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖凝胶，放于Eeppendorf 离心管中，各加入溶胶/结合液，置65℃水浴5分钟使胶溶解，然后分别移入吸附柱后， 按试剂盒说明书进行纯化。

2.3 连接：于灭菌Eeppendorf 离心管中加入上述酶切并纯化后的载体 1μl、目的基因3μl，T4 DNA Ligase 4μl，置16℃连接5h以上。

2.4 转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl HB101感受态细胞(感受态细胞按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法制备)悬液于Eppendorf中， 加入上述连接物8μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入1ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取 0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后， 置37℃恒温箱倒置培养过夜。

2.5 鉴定：挑选菌落分别接种于LB中(5 ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2 ml /管)，32℃培养3小时，pBVIL1载体对应42℃水浴摇床中诱导培养4h，PGEX-4T-2载体对应IPTG 37℃ 诱导，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并经测序鉴定载体中所插入的基因片段完全正确。

3．HN抗原的表达与纯化

3.1表达菌株的培养：取-70℃保存的表达菌株 20μl 接种于LB 培养基中(100ml LB /500ml三角瓶)，37℃ 空气摇床培养过夜，次日按5%的比例转种于LB 培养基(同上)，30℃ 空气摇床培养约3小时，当OD600 值达到 0.7时，立即将培养瓶转到 42℃ 水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000 rpm 离心 20 分钟，弃上清，收集沉淀部分。

3.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的 20 mmol/L pH8.5 TE 缓冲液将沉淀悬起， 加入溶菌酶(1 mg/ml悬液)， 在室温下磁力搅拌10 分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超声3秒钟，间隔7秒钟， 共超声20分钟。4℃， 12000rpm，离心10分钟，弃上清， 沉淀用1mol/L NaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用6 M 脲(用PH8.5 TE 配制)溶解，加1%β-巯基乙醇。再过滤去沉淀取上清。

3.3纯化：将上述溶解的包涵体溶液过Q-SepHNrose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.5，25mmol/L TE 含6 mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl (用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE 鉴定，收集0.05mol/L NaCl 洗脱峰。再过SepHNrdex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。通过上述的离子交换柱和凝胶过滤纯化，获得了四种电泳纯的腮腺炎病毒HN抗原纯品。

4. HN抗原的活性鉴定

将纯化的候选抗原用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释到2.5 μg/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对本室保存的内质控血清(含国内10份腮腺炎疫苗接种者血清和10份疫苗接种前健康献血者血清)进行了测定。原始测定结果如表1所示。经分析的不同HN抗原的活性分析结果如表2所示，其中抗原2、3具有很高的特异性和灵敏度。

表1不同腮腺炎病毒HN抗原活性检测数据

表2 不同腮腺炎病毒HN抗原活性分析结果

实施例3 腮腺炎病毒抗体检测

采用HN抗原2(SEQ ID NO.2)和抗原3(SEQ ID NO.3)包被酶联板，利用间接ELISA法使用羊抗人IgG抗体对腮腺炎疫苗中和抗体进行检测，测定结果以及分析结果如表3所示：90例腮腺炎疫苗接种前标本组中抗原2有3例HN-IgG检测结果为阳性，87例阴性，阳性率为3.3%；抗原3阳性率为8.9%。40例疫苗接种组中抗原2有33例HN-IgG检测为阳性，7例阴性，阳性率为82.5%；抗原3阳性率为95%。疫苗组阳性率显著高于疾病流行前组(P<0.01)。因抗原2、3二者阳性检出有互补，因此抗原2、3同时作为抗体检测试剂具有较高的特异性和灵敏度，在腮腺炎疫苗的疗效评价中具有实用价值。

表3 腮腺炎病毒抗体检测分析结果

序列表

<110> 北京市华信行生物科技有限公司

<120> 腮腺炎HN抗原及其在检测抗腮腺炎病毒抗体中的用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 腮腺炎病毒(Mumps virus)

<400> 1

Val Ile Asn Ala Ala Asp Lys Lys Thr Phe Arg Thr Cys Phe Arg Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Ser Val Gln Ala Val Thr Leu Ile Leu Val Ile Val Thr

20 25 30

Leu Gly Glu Leu Val Arg Met Ile Asn Asp Gln Gly Leu Ser Asn Gln

35 40 45

Leu Ser Ser Ile Thr Asn Lys Ile Arg Glu Ser Ala Thr Met Ile Ala

50 55 60

Ser Ala Val Gly Val Met Asn Gln Val Ile His Gly Val Thr Ile Ser

65 70 75 80

Leu Pro Leu Gln Ile Glu Gly Asn Gln Asn Gln Leu Leu Ser Thr Leu

85 90 95

Ala Thr Ile Cys Thr Ser Lys Lys Gln Val Ser Asn Cys Ser Thr

100 105 110

<210> 2

<211> 100

<212> PRT

<213> 腮腺炎病毒

<400> 2

Asn Cys Lys Asp His Thr Ser Ser Asn Gln Tyr Val Ser Met Gly Ile

1 5 10 15

Leu Val Gln Thr Ala Ser Gly Tyr Pro Met Phe Lys Thr Leu Lys Ile

20 25 30

Gln Tyr Leu Ser Asp Gly Leu Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile Ala Thr

35 40 45

Val Pro Asp Gly Cys Ala Met Tyr Cys Tyr Val Ser Thr Gln Leu Glu

50 55 60

Thr Asp Asp Tyr Ala Gly Ser Ser Pro Pro Thr Gln Lys Leu Thr Leu

65 70 75 80

Leu Phe Tyr Asn Asp Thr Val Thr Glu Arg Thr Ile Ser Pro Ser Gly

85 90 95

Leu Glu Gly Asn

100

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 腮腺炎病毒

<400> 3

Thr Leu Gly Val Lys Ser Ala Arg Glu Phe Phe Arg Pro Val Asn Pro

1 5 10 15

Tyr Asn Pro Cys Ser Gly Pro Gln Gln Asp Leu Asp Gln Arg Ala Leu

20 25 30

Arg Ser Tyr Phe Pro Ser Tyr Phe Ser Asn Arg Arg Val Gln Ser Ala

35 40 45

Phe Leu Val Cys Ala Trp Asn Gln Ile Leu Val Thr Asn Cys Glu Leu

50 55 60

Val Val Pro Ser Asn Asn Gln Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Val

65 70 75 80

Leu Leu Ile Asn Asn Arg Leu Phe Tyr Tyr Gln Arg Ser Thr Ser Trp

85 90 95

Trp Pro Tyr Glu Leu Leu Tyr Glu Ile Ser Phe Thr Phe Thr

100 105 110

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 腮腺炎病毒

<400> 4

Asn Ser Gly Gln Ser Ser Val Asn Met Ser Trp Ile Pro Ile Tyr Ser

1 5 10 15

Phe Thr Arg Pro Gly Ser Gly Ser Cys Ser Gly Glu Asn Val Cys Pro

20 25 30

Thr Ala Cys Val Ser Gly Val Tyr Leu Asp Pro Trp Pro Leu Thr Pro

35 40 45

Tyr Ser His Gln Ser Gly Ile Asn Arg Asn Phe Tyr Phe Thr Gly Ala

50 55 60

Leu Leu Asn Ser Ser Thr Thr Arg Val Asn Pro Thr Leu Tyr Val Ser

65 70 75 80

Ala Leu Asn Asn Leu Thr Val Leu Ala Pro Tyr Gly Thr Gln Gly Leu

85 90 95

Phe Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Thr Cys Phe Gln Asp Thr Gly

100 105 110