本发明涉及复合纳米材料技术、电化学分析检测技术及肿瘤标志物检测技术领域，更具体地说是一种基于复合纳米材料的优良类酶催化性能构建的用于检测肿瘤标志物的高灵敏电化学免疫传感器。
背景技术：
众所周知，癌症是人类的一大健康杀手，准确地检测人类血清和组织中的肿瘤标志物对于癌症的早期筛查和诊断具有重大的意义。近些年来，各种各样的免疫分析方法已经被发展并用于肿瘤标志物的检测。相比于电化学发光、荧光、光电化学、比色、表面等离子体共振等免疫分析方法，电化学免疫分析方法由于其灵敏度高、装置简单、成本低、便携等优点被更广泛应用。
在电化学免疫分析中，标记有酶的生物探针被广泛的使用。尽管这些酶标记的免疫传感器能够达到一定的分析灵敏度，其仍旧存在一些缺陷。因为酶的稳定性较差，其催化活性易受外界环境的影响。特别是在固定和储存的过程中，强酸、强碱、高温及不同极性的溶剂极易导致酶变性。另外酶的制备和纯化成本较高，且费时、费力。相比于酶标记的免疫传感器，无酶的免疫传感器具有成本低、稳定性好及操作简单等优点。因此，发展无酶的免疫传感器对于灵敏地检测肿瘤标志物具有非常重要的意义。
在无酶的免疫传感器的免疫传感器中，金属氧化物、贵金属及其合金由于其优良的生物相容性、导电性及催化活性被广泛的应用。在实际的应用中，这些纳米催化剂仍存在如下缺陷：一、纳米催化剂由于其大的表面积和高的表面活性使其稳定性较差，且容易聚集，这将会极大地降低其催化活性；二、金属氧化物一般具有较差的导电性，这将极大地影响电催化反应过程中电子的转移速率。
在各种各样的金属氧化物中，二氧化铈（CeO2）由于其无毒性、良好的生物相容性、电催化活性等优点使其广泛地用于生物、医药、催化等领域。特别重要的一点是，CeO2可以提供大量的活性面和氧空位，表现出良好的类过氧化物酶性能，其对过氧化氢（H2O2）具有良好电催化还原能力。然而，CeO2纳米晶体容易聚集且具有较差的导电性，这些缺陷将会极大地影响其电催化活性。因此，增强CeO2的导电性及分散性对提高其催化活性是非常有意义的。
氮掺杂的石墨烯（NG）由于其独特的二维结构，大的比表面积和良好的电导性已经被广泛用作高性能的支撑材料。研究表明，氮掺杂不仅能够加速电子在支撑材料与金属界面的传递，而且可以增强纳米粒子在支撑材料上的分散性。以NG为基础的复合纳米材料已经引起了广泛的研究兴趣，由于不同组分的协同作用使其表现出更优越的性能。另外，贵金属（Ag）由于其优越的电导性、良好的生物相容性、催化性能被广泛应用。因此，核壳结构的Ag@CeO2与NG的复合材料（NG-Ag@CeO2）将会表现出良好的催化活性、生物相容性、电导性和大的表面积，将其标记在信号抗体（Ab2）上，作为新型的模拟酶信号标签，有效地催化还原H2O2，实现分析信号的放大，提高检测的灵敏度。
在电化学免疫分析中，将特定的生物分子有效地固定在基质上对于实现灵敏的分析具有重要的作用。一维的氧化锌（ZnO）纳米棒由于其导电性好、生物相容性高、成本低被广泛应用。本文采用简单的水热法在修饰有金（Au）纳米粒子的氧化铟锡（ITO）导电玻璃上合成了由一维ZnO纳米棒组装成的由中心出发向四周发散的三维放射状的ZnO。该三维放射状的ZnO具有大的表面积、良好的导电性和生物相容性，可以作为一个高性能的阵列用来负载大量的捕获抗体（Ab1），进一步提高检测的灵敏度。
本文首次合成了具有良好的催化活性、生物相容性、电导性和大的表面积的NG-Ag@CeO2，其对H2O2表现出良好的电催化还原能力，将其标记在Ab2上，作为新型的模拟酶信号标签，可以极大地放大分析信号。此外，利用简单水热法合成三维放射状的ZnO，其表现出大的表面积、良好的导电性和生物相容性，可以负载大量的Ab1，进一步提高免疫传感器检测的灵敏度。该高灵敏的无酶电化学免疫传感器表现出线性范围宽、检测限低、重现性好、稳定性高等优良的分析性能，其在临床分析不同的肿瘤标志物方面具有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是通过合成高性能的类酶纳米催化剂NG-Ag@CeO2和三维放射状的ZnO，构建高灵敏的无酶电化学免疫传感器，实现对肿瘤标志物的准确、灵敏检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：
（1）在ITO导电电极上沉积一层Au纳米粒子：首先将ITO导电电极依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min，将清洗后的电极插入含有1%-5% HAuCl4的沉积液中，利用电位溶出分析法，在沉积电位为-0.2 V，沉积时间为30-60 s，将Au纳米粒子沉积在ITO导电电极的表面，沉积完成后，用二次水清洗电极表面，并在室温下自然干燥，获得ITO-Au电极；
（2）利用简单水热法在步骤（1）中获得ITO-Au电极表面生长三维放射状的ZnO：将ITO-Au电极插入含有10-15 mL硝酸锌和六次甲基四胺混合液的25 mL高压釜中，使ITO-Au电极倾斜地靠在高压釜内壁上，且导电面向下，所述的硝酸锌和六次甲基四胺的浓度均为5-10 mM且摩尔比为1:1，在90-100 ℃加热4-6 h，待冷却到室温后用二次水洗涤电极表面，并在60 ℃干燥3 h，获得ITO-Au-ZnO电极；
（3）利用简单的水热法合成类酶纳米催化剂NG-Ag@CeO2，首先合成NG：将15-20 mL 28% 氨水加入到20-25 mL 2 mg mL−1氧化石墨烯分散液中，然后加入300-350 mg氢氧化钠，磁力搅拌30 min，将获得的混合液转移到80 mL的高压釜中，在180-200 ℃加热10-12 h，待冷却到室温后，将获得的混合液用0.01 M的盐酸离心洗涤至中性，再分别用乙醇和二次水各离心洗涤3次，最后将获得的样品在60 ℃真空干燥4 h；然后合成NG-Ag：称取5 mg NG 溶于5 mL二次水中，超声溶解30 min，加入200-300 μL 70-80 mM硝酸银，在室温下搅拌1 h，随后加入100-200 μL 30-40 mM硼氢化钠，继续在室温下搅拌1 h后，用二次水离心洗涤3次，将获得的NG-Ag重新分散在5 mL二次水中；最后合成NG-Ag@CeO2：将0.2-0.4 mmol硝酸铈溶解在20 mL二次水和20 mL乙醇中，然后加入5 mL获得的NG-Ag，再逐滴加入10 mL 0.85%-1%的精氨酸，将获得混合液在80-100 ℃磁力搅拌加热3-5 h，将获得产品用丙酮和二次水各离心洗涤3次，并在60 ℃干燥3 h；
（4）合成NG-Ag@CeO2-Ab2：称取2 mgNG-Ag@CeO2分散在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中， 然后加入0.1 mL 2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.1 mL 2.5% 戊二醛和200 μL 20 μg mL-1 Ab2，在室温下震荡孵化2 h，随后用pH 7.4 PBS离心洗涤3次，获得NG-Ag@CeO2-Ab2，将获得NG-Ag@CeO2-Ab2重新分散在1 mL pH 7.4 PBS中；
（5）无酶电化学免疫传感器的构建：将20 μL 0.1 mM对氨基苯硫酚滴涂到步骤（2）中获得的ITO-Au-ZnO电极表面，并在室温下孵化4 h，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的对氨基苯硫酚，然后再将ITO-Au-ZnO插入含有2.5%戊二醛的溶液中2 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，将10 μL 20 μg mL-1 Ab1滴涂到电极表面，并在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的Ab1后，继续滴涂10 mL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点，利用pH 7.4 PBS洗涤后，滴加10 μL不同浓度的肿瘤标志物，在37 ℃下孵化30 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的肿瘤标志物，最后滴涂10 μL步骤（4）中获得的NG-Ag@CeO2-Ab2，并在37 ℃下孵化40 min，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的NG-Ag@CeO2-Ab2，完成无酶电化学免疫传感器的构建；
（6）采用差分脉冲伏安法在由修饰后的ITO-Au-ZnO工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中进行电化学信号检测，电压范围为-1 ~ 0V，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为50 ms，所用的检测溶液为5 mL含有2 mM H2O2的pH 7.4 PBS溶液，通过电化学信号与肿瘤标志物浓度之间的关系，实现对肿瘤标志物的检测。
本发明的有益效果：
（1）通过简单的水热法合成的类酶纳米催化剂NG-Ag@CeO2具有良好的催化活性、生物相容性、电导性和大的表面积，作为新型的模拟酶信号标签，对H2O2具有良好的电催化还原能力，可以实现分析信号的放大，提高检测的灵敏度。
（2）利用简单的水热法合成的三维放射状的ZnO表现出大的表面积、良好的导电性和生物相容性，作为一个高性能的阵列可以负载大量的Ab1，进一步提高检测的灵敏度。
（3）本发明构建的高灵敏的无酶电化学免疫传感器具有良好的特异性、重现性和稳定性，为临床分析肿瘤标志物提供了一个良好的分析平台，对癌症的早期筛查和诊断具有重大的意义。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1: 高灵敏的无酶电化学免疫传感器用于癌胚抗原（CEA）中的检测
（1）在ITO导电电极上沉积一层Au纳米粒子：首先将ITO导电电极依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min，将清洗后的电极插入含有1% HAuCl4的沉积液中，利用电位溶出分析法，在沉积电位为-0.2 V，沉积时间为30 s，将Au纳米粒子沉积在ITO导电电极的表面，沉积完成后，用二次水清洗电极表面，并在室温下自然干燥，获得ITO-Au电极；
（2）利用简单水热法在步骤（1）中获得ITO-Au电极表面生长三维放射状的ZnO：将ITO-Au电极插入含有15 mL硝酸锌和六次甲基四胺混合液的25 mL高压釜中，使ITO-Au电极倾斜地靠在高压釜内壁上，且导电面向下，所述的硝酸锌和六次甲基四胺的浓度均为5 mM且摩尔比为1:1，在90 ℃加热4 h，待冷却到室温后用二次水洗涤电极表面，并在60 ℃干燥3 h，获得ITO-Au-ZnO电极；
（3）利用简单的水热法合成类酶纳米催化剂NG-Ag@CeO2，首先合成NG：将15 mL 28% 氨水加入到20 mL 2 mg mL−1氧化石墨烯分散液中，然后加入300 mg氢氧化钠，磁力搅拌30 min，将获得的混合液转移到80 mL的高压釜中，在200 ℃加热12 h，待冷却到室温后，将获得的混合液用0.01 M的盐酸离心洗涤至中性，再分别用乙醇和二次水各离心洗涤3次，最后将获得的样品在60 ℃真空干燥4 h；然后合成NG-Ag：称取5 mg NG 溶于5 mL二次水中，超声溶解30 min，加入250 μL 75 mM硝酸银，在室温下搅拌1 h，随后加入100 μL 35 mM硼氢化钠，继续在室温下搅拌1 h后，用二次水离心洗涤3次，将获得的NG-Ag重新分散在5 mL二次水中；最后合成NG-Ag@CeO2：将0.2 mmol硝酸铈溶解在20 mL二次水和20 mL乙醇中，然后加入5 mL获得的NG-Ag，再逐滴加入10 mL 0.85%的精氨酸，将获得混合液在80 ℃磁力搅拌加热3 h，将获得产品用丙酮和二次水各离心洗涤3次，并在60 ℃干燥3 h；
（4）将NG-Ag@CeO2标记在与CEA的相应的Ab2（CEA-Ab2）上，获得NG-Ag@CeO2-CEA-Ab2：称取2 mgNG-Ag@CeO2分散在1 mL pH 7.4 PBS中，然后加入0.1 mL 2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.1 mL 2.5% 戊二醛和200 μL 20 μg mL-1 CEA-Ab2，在室温下震荡孵化2 h，随后用pH 7.4 PBS离心洗涤3次，获得NG-Ag@CeO2-CEA-Ab2，将获得NG-Ag@CeO2-CEA-Ab2重新分散在1 mL pH 7.4 PBS中；
（5）无酶电化学免疫传感器的构建：将20 μL 0.1 mM对氨基苯硫酚滴涂到步骤（2）中获得ITO-Au-ZnO电极表面，并在室温下孵化4 h，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的对氨基苯硫酚，然后再将ITO-Au-ZnO插入含有2.5%戊二醛的溶液中2 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，将10 μL 20 μg mL-1与CEA的相应的Ab1（CEA-Ab1）滴涂到电极表面，并在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的CEA-Ab1后，继续滴涂10 mL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点，利用pH 7.4 PBS洗涤后，滴加10 μL不同浓度的CEA，在37 ℃下孵化30 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的CEA，最后滴涂10 μL步骤（4）中获得的NG-Ag@CeO2-CEA-Ab2，并在37 ℃下孵化40 min，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的NG-Ag@CeO2-CEA-Ab2，完成无酶电化学免疫传感器的构建；
（6）采用差分脉冲伏安法在由修饰后的ITO-Au-ZnO工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中进行电化学信号检测，电压范围为-1 ~ 0V，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为50 ms，所用的检测溶液为5 mL含有2 mM H2O2的pH 7.4 PBS溶液，通过电化学信号与CEA浓度之间的关系，实现对CEA的检测。