一种虫草类药材样品中两种微量核苷的检测方法与流程

本发明涉及药材中特定成分含量的分析检测方法，具体涉及一种在线固相萃取-HPLC法快速分析虫草类样品中两种微量核苷类成分3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的方法。

技术背景

虫草是寄生于昆虫、少数真菌和植物体上的一类真菌，是广义虫草属真菌的总称，是具有营养、保健和医疗功效的宝贵生物资源，目前我国的虫草产业涉及了冬虫夏草、蛹虫草、蝉花及其相关真菌的发酵菌丝体等，已经形成了一个巨大的产业，实现了较高的经济价值和社会效益。虫草素是最早从蛹虫草(Cordyceps militaris)中分离得到的一种物质，化学名称为3′-脱氧腺苷，也是第一个从真菌中分离出来的抗菌性物质，之后许多学者对其进行了验证研究。现代药理学研究表明虫草素还具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用。冬虫夏草中虫草素的存在与否一直存在争议。2′-脱氧腺苷也是广泛存在于虫草类物种中的一种成分，是虫草素的同分异构体，其俗名为异虫草素，其与虫草素仅一个羟基位置有所差异，两者结构如下式所示。由于两者结构非常相似，分子量相同，分离较难，紫外光谱相似，容易造成错误判断。目前主要通过高效液相-质谱联用的方法对两种成分进行分离和定量分析，操作复杂，对仪器要求较高。

固相萃取技术(Solid Phase Extraction,SPE)是色谱分析样品重要的前处理方法，可将痕量被测组分进行浓缩富集，使样品净化后将被测组分从样品基体中转移到溶剂或气体中进行分析检测。目前SPE技术已广泛应用于中药材中的微量物质分析。但是离线SPE在提取、洗脱后仍需溶剂挥干和重溶等步骤，耗时耗力，易造成待测物质的损失。

经本申请发明人的研究还发现，很多技术文献使用HPLC方法所测定的虫草素并非真正的3′-脱氧腺苷峰，而是2′-脱氧腺苷或者是与其同分异构体3′-脱氧腺苷混合物的峰。而且由于虫草类样品中3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷含量低，使用普通的紫外检测器很难检测，一般需使用高效液相色谱联合价格昂 贵的质谱仪才能进行检测，不易准确反映样品中虫草素和异虫草素的真实含量。

技术实现要素：

本发明以3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷为对照品，通过在线固相萃取-HPLC分析方法，能够测定虫草类样品中两者的准确含量。本发明将为虫草素新的生产和开发工艺提供一种简单快速、价格低廉的分析方法。

本发明的目的在于提供一种快速、简便、稳定而又准确的测定虫草类样品中3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷的在线固相萃取-HPLC方法。本发明通过使用两种对照品和优化色谱条件，成功地将原来被认为是3′-脱氧腺苷峰的单峰分离为3′-脱氧腺苷峰和2′-脱氧腺苷峰，将能更加准确地反映虫草类样品中3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷的含量。

本发明提供了一种在线固相萃取-HPLC法分析虫草类样品中3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的分析方法，包括以下测定步骤：

a、供试品溶液的制备：准确称取样品粉末适量，置于离心管中，加入适量超纯水，混匀，超声提取，摇匀，离心，取上清液过膜，即得供试品溶液；

b、混合对照品溶液的制备：精密称取3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷对照品适量，用100mL容量瓶定容，得浓度为201.4μg/mL的3’-脱氧腺苷和198.5μg/mL的2’-脱氧腺苷混合对照品溶液；

c、在线固相萃取-HPLC测定：检测装置包括固相萃取柱、分析柱、六通阀、废液收集器和检测器；其中固相萃取柱为ZORBAX SB-AQ柱，柱长为12.5mm，内径为4.6mm，填料粒直径为5μm；分析柱为ZORBAX SB-AQ柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，填料粒直径为5μm；混合对照品溶液和供试品溶液检测器类型为紫外检测器；检测条件为：流速为1mL/min，柱温为40℃，进样量为40μL，检测波长：260nm；检测方法为：样品进样后经过固相萃取柱净化富集，首先采用9％甲醇水溶液冲洗3min，除去杂质，3min时由废液流路切换至分析流路，3-5min时流动相逐渐转化为0.1％甲酸水-甲醇溶液，其体积比为91:9，继续洗脱12min；

d、混合对照品分别进样1μL、5μL、10μL、20μL、30μL和40μL，供试品进样40μL，分别测定峰面积，根据混合对照品峰面积与浓度制作对照品3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的标准曲线，计算线性方程和相关系数；

e、根据所得的供试品峰面积和步骤d线性方程计算供试品中3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的含量。

在一些实施例中，所述供试品溶液的制备方法为：准确称取样品粉末1.0g，置于5mL离心管中，加入4mL的超纯水，混匀，超声提取30min，超声频率40kHz，超声功率500w，摇匀，离心5min，转速为12000rpm，取上清液，经0.22μm水系滤膜，即得供试品溶液。

在一些实施例中，所述混合对照品溶液的制备方法为：精密称取20.14mg的3’-脱氧腺苷对照品置 于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，得浓度为201.4μg/mL的3’-脱氧腺苷对照品溶液；精密称取19.85mg的2’-脱氧腺苷对照品置于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，得浓度为198.5μg/mL的2’-脱氧腺苷对照品溶液；准确量取两对照品溶液1mL，置于100mL容量瓶中用超纯水定容至刻度，得混合对照品溶液。

在一些实施例中，所述的在线固相萃取-HPLC测定的检测装置包括固相萃取柱、六通阀、废液收集器、分析柱和检测器；检测装置安装方式为：废液流路为固相萃取柱、六通阀1-6流路与废液收集器联通；分析流路为固相萃取柱、六通阀1-2流路、分析柱、检测器和废液收集器联通。

在一些实施例中，所述的虫草类样品，包括冬虫夏草，中国被毛孢菌丝体，蝉花和蛹虫草。

经方法学考察，本发明方法系统适应性良好，3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的定量限分别为0.0247μg/mL和0.0243μg/mL；检测限分别为0.0123μg/mL和0.0122μg/mL；日内精密度(RSD)分别为0.095％和0.14％，日间精密度分别为为0.12％和0.25％；重复性和稳定性试验采用冬虫夏草样品，3’-脱氧腺苷未检测到色谱峰，2’-脱氧腺苷的重复性和稳定性(RSD)分别为2.94％和2.87％；加样回收的平均回收率分别为99.3％和100.4％，RSD分别为2.65％和3.97％。方法学考察结果显示本发明方法准确、稳定，可用于3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的检测。

本发明的积极效果在于：

(1)本发明建立了一种灵敏、稳定、简便、快速的分析3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的在线固相萃取-HPLC分析方法，可以在15min实现3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的基线分离和定量，大大的节约了分析时间和成本。

(2)通过六通阀切换流路使供试品中杂质不经过分析柱而直接进入废液收集装置，起到保护分析柱的作用。

(3)本发明方法操作简单，易于大规模推广使用，仅需普通紫外检测器，无需昂贵的质谱检测器就可实现准确定量分析，适用于冬虫夏草、虫草菌丝粉、蛹虫草、蝉花等多种虫草样品的检测。

附图说明

图1：分析系统安装示意图。

图2：3’-脱氧腺苷标准曲线图。

图3：2’-脱氧腺苷标准曲线图。

图4：3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷混合对照品HPLC色谱图。

图5：冬虫夏草样品HPLC色谱图。

图6：中国被毛孢菌丝体样品HPLC色谱图。

图7：蝉花样品HPLC色谱图。

图8：蛹虫草样品HPLC色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。应该指出的是，对于本领域的技术人员来说，在此发明创造的基础上，做出的任何变形和改进，都属于本发明的保护范围，实施例中所有原料均可以通过商业途径获得。

实施例1

冬虫夏草样品的定量分析。

(1)实验材料

冬虫夏草，采集自青海果洛。

(2)仪器和试剂

Agilent1260高效液相色谱仪，配有两个二元泵、自动进样器、柱温箱、六通阀、VWD紫外检测器(美国Agilent公司)，KQL-100B1超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，Votex-Genie 2涡旋仪(美国Scientific industries公司)，XS205十万分之一天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，XS204万分之一天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，5424离心机(德国Eppenfdorf公司)。

对照品3’-脱氧腺苷(上海融禾医药有限公司，批号：150306)、2’-脱氧腺苷(百灵威科技有限公司，批号151008)，纯度均大于98％。甲酸(色谱纯，阿拉丁公司)、磷酸(色谱纯，成都科龙化工试剂厂)、甲醇(色谱纯，美国spectrum公司)、试验用水为超纯水(美国Millipore公司)。

(3)供试品溶液的制备

准确称取冬虫夏草样品粉末1.0g，置于5mL离心管中，加入4mL的超纯水，混匀，超声提取30min(频率40kHz，功率500w)，摇匀，离心5min(12000rpm)，取上清液，经0.22μm水系滤膜即得供试品溶液。

(4)色谱条件

固相萃取柱：ZORBAX SB-AQ(12.5mm×4.6mm，5μm)；分析柱：ZORBAX SB-AQ(150mm×4.6mm，5μm)；进样体积：40μL；检测装置安装如图1所示；在线净化流动相为水-甲醇(91:9)，等度洗脱3min，除去杂质，洗脱液经废液流路入废液收集器；六通阀切换流路至分析流动相流路，3-5min时流动相逐渐转化为0.1％甲酸水溶液-甲醇(91:9)，继续洗脱12min；流速为1mL/min，柱温40℃，检测波长为260nm。

(5)检测结果

冬虫夏草样品检测结果见表1，HPLC图谱见图5。

实施例2

中国被毛孢菌丝体样品的定量分析。

(1)实验材料

中国被毛孢菌丝体，由宜昌山城水都冬虫夏草有限公司提供。

(2)仪器和试剂

同实施例1。

(3)供试品溶液的配制

准确称取中国被毛孢菌丝体样品粉末1.0g，置于5mL离心管中，加入4mL的超纯水，混匀，超声提取30min(频率40kHz，功率500w)，摇匀，离心5min(12000rpm)，取上清液，经0.22μm水系滤膜即得供试品溶液。

(4)色谱条件

同实施例1。

(5)检测结果

中国被毛孢菌丝体样品检测结果见表1，HPLC图谱见图6。

实施例3

蝉花样品的定量分析。

(1)实验材料

蝉花，购自江西大别山。

(2)仪器和试剂

同实施例1。

(3)供试品溶液的配制

准确称取蝉花样品粉末1.0g，置于5mL离心管中，加入4mL的超纯水，混匀，超声提取30min(频率40kHz，功率500w)，摇匀，离心5min(12000rpm)，取上清液，经0.22μm水系滤膜即得供试品溶液。

(4)色谱条件

同实施例1。

(5)检测结果

蝉花样品检测结果见表1，HPLC图谱见图7。

实施例4

蛹虫草样品的定量分析。

(1)实验材料

蛹虫草，由宜昌山城水都冬虫夏草有限公司提供。

(2)仪器和试剂

同实施例1。

(3)供试品溶液的配制

准确称取蛹虫草样品粉末1.0g，置于5mL离心管中，加入4mL的超纯水，混匀，超声提取30min(频率40kHz，功率500w)，摇匀，离心5min(12000rpm)，取上清液，经0.22μm水系滤膜即得供试品溶液。

(4)色谱条件

同实施例1。

(5)检测结果

蛹虫草样品检测结果见表1，HPLC图谱见图8。

表1样品测定结果(mg/g)

由表1数据可知，冬虫夏草、中国被毛孢菌丝粉和蝉花样品中均未检测到3’-脱氧腺苷，中国被毛孢菌丝粉中2’-脱氧腺苷含量最高，蝉花次之，冬虫夏草中含量最低；蛹虫草中含有3’-脱氧腺苷，2’-脱氧腺苷含量较低未达检测限。