本发明涉及一种磁微粒化学发光法人类免疫缺陷病毒抗原及抗体测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
目前人类免疫缺陷病毒测定试剂盒已经发展到第四代，即抗原及抗体(HIV Ag/Ab)同时进行检测，市面上多为酶免法，例如万泰和英科新创等厂家的试剂，这种方法将抗原和抗体通过包被的方式固定在酶标板反应孔中，然后将样本或处理后的样本加入反应孔，孵育之后进行洗涤，洗涤完成之后再加入酶标抗原和抗体进行反应，反应完成之后加入底物液进行显色，通过显色的深浅判断样本阴阳性。
一般来说，酶免法有其优势，即抗原和抗体的包被对其生物活性影响很小，所以对待检抗原和抗体的结合有着很好的识别作用，但是缺点也很明显：1)由于抗原和抗体是包被在板上，所以在和样本中待检抗原和抗体结合时很难进行完全的反应，因此会对结果有一定的影响；2)在洗涤效果上，由于96孔板的方式为洗液针对一个包被平面的清洗，而且微孔体积较小，洗液流速较慢，所以洗涤效果较差；3)且酶免法由于要进行比色，而颜色的深浅决定了此方法线性范围较窄，如果要研发定量检测试剂盒则线性范围是一个缺陷，即检测高值样本容易出现HOOK效应，那么临床上对于某些超出线性范围的高值样本就需要进行稀释，进行复检，增加了检测的复杂程度。
后期在酶免的基础上发展出了板式化学发光的方法，代表厂家有科美东雅，对于检测线性范围来讲，化学发光相对于酶免有了很大的提高，但是由于其仍然是包被的方法，因此在和样本的充分反应方面还是有着先天的不足，存在着反应效率较低，孵育时间较长的缺点。
磁微粒化学发光法的出现克服了上述酶免和板式化学方法的缺陷，同时又继承了上述两种方法的优点：1)将抗原或抗体与磁微粒进行结合，这样磁微粒与样本的反应就在一种近似于均相的反应体系中进行，可以缩短反应时间；2)在清洗的过程中，由于磁微粒浸泡在洗液中，而且可以进行高速地震荡混匀，因此洗涤效果要好；3)由于磁珠比表面积很大，因此极少量的磁珠所结合的抗原或抗体量就远大于96孔板的抗原或抗体结合量，试剂的HOOK浓度点就会比酶免和板式化学发光高很多。
市面上磁微粒应用最广泛的有以下两类：一是修饰了羧基、氨基或羟基等的活性基团的磁微粒，在偶联抗体时，会通过化学键的作用与抗原或抗体的氨基或其他基团结合；也有表面修饰抗FITC抗体或链霉素的磁微粒，这样就需要对抗原或抗体进行FITC或生物素的偶联，使抗原或抗体能够间接与磁微粒结合。
磁微粒虽然有上述优势，但是也有不足，以上两类磁珠使用时均需要对抗原或抗体进行偶联，这表示抗原或抗体会有不同程度的活性损失，由于不同项目的抗体一致性较高，偶联位点均为恒定区，抗体的可变区(识别抗原的区域)活性基本不受影响，而不同项目抗原则特异性很强，活性区域也不固定，偶联的位置如果是活性区，则磁珠偶联的抗原结合待检抗体时就会出现差错导致检测结果不准确；不仅如此，包被抗原或抗体偶联FITC或生物素后就需要在检测中额外加入磁珠孵育的步骤，导致检测时间增加。
通常情况下，需要磁珠偶联抗原的项目多为传染病项目(部分为自免项目)，人类免疫缺陷病毒就属于这类项目，因此检验结果的准确性就显得非常重要。一种既有包被方法的抗原活性损失小的优势，又有磁微粒化学发光易洗涤、线性范围宽优势的试剂盒无疑会非常符合市场的需求。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种磁微粒化学发光法人类免疫缺陷病毒抗原及抗体测定试剂盒及其制备方法通过使用一种磁微粒，首次将抗原损失小、反应时间短及易洗涤、线性范围宽的优点进行结合，使检验结果可以和酶免法一致，反应时间有了明显地缩短。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明一种磁微粒化学发光法人类免疫缺陷病毒抗原及抗体测定试剂盒，其包括磁分离试剂、酶标试剂、阴/阳性对照品和定标液；所述的磁分离试剂为磁微粒结合包被抗原/抗体；所述的酶标试剂为检测抗原/抗体偶联碱磷酶；其中包被抗原和检测抗原均为重组抗原，包被抗体和检测抗体均为鼠单抗；所述定标液中包含待检抗原和抗体；所述磁微粒的表面为疏水性表面，其被磺酰基修饰，通过吸附作用结合抗原或抗体。
本发明的另一个方面公开了一种磁微粒化学发光法人类免疫缺陷病毒抗原及抗体测定试剂盒，其包括以下步骤：
S1、磁分离试剂的制备：
S11、将包被抗原和抗体按照一定比例(4：1)混合后与磁微粒(5mg/ml)按照1：50的投料量进行混合(0.2mg：10mg)，充分进行混匀，在室温的条件下持续反应18小时；
S12、将步骤S11制得的混合物置于磁场中进行分离，用0.1*PBS进行洗涤，共洗涤3次，每次加入0.1*PBS1ml；
S13、将洗涤后的磁微粒用1mg/ml的聚乙二醇1ml进行封闭，混匀2小时；
S14、按照步骤S12的操作进行清洗；
S15、将磁微粒使用磁分离试剂缓冲液稀释至0.5mg/ml作为工作液；
S2、酶标试剂的制备：
S21、将检测抗原/抗体按照一定比例(4：1)混合后用0.1*PBS进行透析，然后用2IT进行活化；
S22、将碱磷酶用SMCC进行活化；
S23、将活化后的抗原/抗体混合物和碱磷酶进行混合，2-8°反应18小时；
S24、将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰和II峰进行混合后，用抗试剂缓冲液将混合物稀释至0.2ug/ml作为工作液使用。
S3、阴/阳性对照品和定标液制备步骤如下：
S31、阴性对照品为该项目定标液专用缓冲液；
S32、定标液为定标液专用缓冲液加入待测抗原和抗体使终浓度分别为0.5ug/ml和1ug/ml。
S33、阳性对照品为定标液专用缓冲液加入待测抗原和抗体使终浓度分别为0.8ug/ml和1.5ug/ml。
本发明所达到的有益效果是：
本发明提供的试剂盒，既具有包被方法的抗原活性损失小的优势，又有磁微粒化学发光易洗涤、线性范围宽优势；本发明通过使用一种磁微粒，首次将抗原损失小、反应时间短及易洗涤、线性范围宽的优点进行结合，使检验结果可以和酶免法一致，反应时间有了明显地缩短。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明一种磁微粒化学发光法人类免疫缺陷病毒抗原及抗体测定试剂盒，其包括磁分离试剂、酶标试剂、阴/阳性对照品和定标液；所述的磁分离试剂为磁微粒结合包被抗原/抗体；所述的酶标试剂为检测抗原/抗体偶联碱磷酶；其中包被抗原和检测抗原均为重组抗原，包被抗体和检测抗体均为鼠单抗；所述定标液中包含待检抗原和抗体；所述磁微粒的表面为疏水性表面，其被磺酰基修饰，通过吸附作用结合抗原或抗体。
上述一种磁微粒化学发光法人类免疫缺陷病毒抗原及抗体测定试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
S1、磁分离试剂的制备：
S11、将包被抗原和抗体按照一定比例(4：1)混合后与磁微粒(5mg/ml)按照1：50的投料量进行混合(0.2mg：10mg)，充分进行混匀，在室温的条件下持续反应18小时；
S12、将步骤S11制得的混合物置于磁场中进行分离，用0.1*PBS进行洗涤，共洗涤3次，每次加入0.1*PBS1ml；
S13、将洗涤后的磁微粒用1mg/ml的聚乙二醇1ml进行封闭，混匀2小时；
S14、按照步骤S12的操作进行清洗；
S15、将磁微粒使用磁分离试剂缓冲液稀释至0.5mg/ml作为工作液；
S2、酶标试剂的制备：
S21、将检测抗原/抗体按照一定比例(4：1)混合后用0.1*PBS进行透析，然后用2IT进行活化；
S22、将碱磷酶用SMCC进行活化；
S23、将活化后的抗原/抗体混合物和碱磷酶进行混合，2-8°反应18小时；
S24、将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰和II峰进行混合后，用抗试剂缓冲液将混合物稀释至0.2ug/ml作为工作液使用。
S3、阴/阳性对照品和定标液制备步骤如下：
S31、阴性对照品为该项目定标液专用缓冲液；
S32、定标液为定标液专用缓冲液加入待测抗原和抗体使终浓度分别为0.5ug/ml和1ug/ml。
S33、阳性对照品为定标液专用缓冲液加入待测抗原和抗体使终浓度分别为0.8ug/ml和1.5ug/ml。
为了更好的进行比较，我们同时将包被抗原/抗体用羧基磁珠、FITC和生物素系统进行了偶联，偶联完成后配分别制成0.5mg/ml、0.8ug/ml和0.4ug/ml作为工作液。
用上述4种固相试剂(抗原/抗体-磺酰基磁珠，抗原/抗体-羧基磁珠，抗原/抗体-FITC，抗原/抗体-生物素)配合酶标试剂、阴/阳对照品和定标液测试国家盘。
由测试结果可以看出，对于抗原检测，4种偶联方式检出结果与国家盘给值一致，但是磺酰基磁珠偶联物检测结果阳性样本值更高，而阴性样本值更低，明显对样本中的抗原检测更敏感；对于抗体检测，应用磺酰基磁珠的试剂测试国家盘效果最好，而同样的原料通过化学键偶联之后检测结果出现不少假阴性和假阳性，且灵敏度不能测出，因此，本发明中的磺酰基磁珠偶联抗原/抗体对样本检测效果最好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换，均在本发明的保护之内。