检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法与流程

本发明涉及医药领域，具体而言，本发明涉及一种检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法。
背景技术：
：骨化三醇是维生素d3的类似物，是人体内维生素d3最重要的代谢活性产物之一。骨化三醇难溶于水和实验室常见的有机溶剂，紫外响应较弱，而且成品骨化三醇软胶囊规格只有0.5微克，难以准确称量。因而，测定骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法仍有待进一步研究。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法。在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：通过hplc法对所述骨化三醇软胶囊中骨化三醇进行检测，其中，所述hplc法采用下列条件进行梯度洗脱：时间(min)流动相a(v％)流动相b(v％)056444.0564410.0336715.0010030.0010031.0564440.05644其中，所述流动相a为10体积％乙腈水溶液，所述流动相b为乙腈。由此，采用该方法可以准确测定骨化三醇软胶囊中骨化三醇的含量。另外，根据本发明上述实施例的检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇的方法还可以具有如下附加的技术特征：在本发明的一些实施例中，所述hplc法的条件进一步包括：hplc色谱柱：c18，2.7微米，4.6×150毫米或等效柱；流速：1.2毫升/分钟；进样体积：10微升；柱温：33～37摄氏度；检测波长：265纳米。由此，可以提高根据本发明实施例的检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法的检测效率和准确度。在本发明的一些实施例中，基于下式确定所述骨化三醇软胶囊中骨化三醇的含量：其中，aspl表示hplc法检测图谱中待测骨化三醇的峰面积；astd表示hplc法检测图谱中骨化三醇对照品的峰面积；wr表示骨化三醇对照品的重量；wc表示骨化三醇对照品储备溶液的总重量；w1表示称取的骨化三醇对照品储备溶液的重量；w2表示骨化三醇对照品溶液的总重量；p表示骨化三醇对照品的纯度；m表示软胶囊的平均装样量；lc表示所述骨化三醇软胶囊中的骨化三醇标示量，其中，所述骨化三醇对照品为已知纯度的骨化三醇；所述骨化三醇对照品储备溶液是称取已知重量的骨化三醇并溶解得到的；所述骨化三醇对照品溶液是将所述骨化三醇对照品储备溶液稀释得到的。由此，可以进一步提高测得骨化三醇含量的准确性。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是根据本发明一个实施例的检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法流程示意图；图2是根据本发明一个实施例的空白溶液的hplc谱图；图3是根据本发明一个实施例的分离度溶液的hplc谱图；图4是根据本发明一个实施例的骨化三醇对照品的hplc谱图；图5是根据本发明一个实施例的待测骨化三醇的hplc谱图；图6是根据本发明一个实施例的定位溶液的hplc谱图；图7是根据本发明一个实施例的正常样品的hplc谱图；图8是根据本发明一个实施例的酸处理样品的hplc谱图；图9是根据本发明一个实施例的碱处理样品的hplc谱图；图10是根据本发明一个实施例的氧化处理样品的hplc谱图；图11是根据本发明一个实施例的高温处理样品的hplc谱图；图12是根据本发明一个实施例的光照处理样品的hplc谱图；图13是根据本发明一个实施例的骨化三醇标准曲线图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法。下面参考图1，对根据本发明实施例的检测骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的方法进行详细描述。根据本发明的实施例，该方法包括：s100：制备对照品储备溶液在该步骤中，制备骨化三醇对照品储备溶液。具体的，采用下列步骤平行制备2份对照品储备溶液：(a)准确称量骨化三醇对照品置于200ml容量瓶中，(b)加入乙腈使其溶解，(c)加入稀释剂辛酸癸酸甘油三酯至溶液总重量为100g，(d)将得到的溶液进行超声处理10min，(e)上下倒转振摇容量瓶不少于10次，使骨化三醇对照品充分溶解。根据本发明的一个实施例，准确称量骨化三醇对照品的重量并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，可以准确称量1.8～2.2mg骨化三醇对照品，发明人通过实验意外地发现，准确称取该重量的骨化三醇对照品可以显著提高后续检测步骤中检测结果的准确性。根据本发明的再一个实施例，加入乙腈的体积并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，加入乙腈的体积可以为2ml，发明人通过实验意外地发现，通过加入该体积的乙腈可以使骨化三醇对照品易于溶解，从而进一步提高后续检测步骤中检测结果的准确性。s200：制备对照品溶液在该步骤中，通过称取对照品储备溶液进行稀释制备对照品溶液。具体的，(f)称取对照品储备溶液至100ml容量瓶中，(g)加入稀释剂辛酸癸酸甘油三酯至溶液总重量为50g，(h)振摇使溶液混合均匀。发明人发现，在加入稀释剂的过程中须避免产生气泡并快速完成，从而减少对照品与光和空气接触，由此，可以进一步提高后续检测步骤中检测结果的准确性。根据本发明的一个实施例，称取对照品储备溶液的重量并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，可以称取8g的对照品储备溶液，由此，可以进一步提高后续检测步骤中检测结果的准确性。s300：制备分离度溶液在该步骤中，量取对照品溶液至20ml容量瓶中，进行水浴加热处理后冷却至室温。根据本发明的一个实施例，量取对照品溶液的体积并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，量取对照品溶液的体积可以为10ml。发明人通过实验意外地发现，量取该体积的对照品溶液制备分离度溶液可以进一步提高后续检测步骤中检测结果的准确性。根据本发明的再一个实施例，水浴加热处理的条件并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，水浴加热处理的条件可以为在90摄氏度水浴中加热45分钟。发明人通过实验意外地发现，采用该条件处理分离度溶液可以进一步提高后续检测步骤中检测结果的准确性。根据本发明的又一个实施例，将分离度溶液重复进行水浴加热处理至骨化三醇与其异构体在hplc谱图中的分离度不低于1.5。由此，可以确证后续检测步骤中hplc法条件可以实现骨化三醇与骨化三醇异构体的分离，保证了hplc法的适用性。s400：制备样品溶液在该步骤中，称取10粒骨化三醇软胶囊，总重为m1，将软胶囊切开并加入乙醇充分溶解内容物，用注射器将内容物的乙醇溶液抽出即为样品溶液，剩余胶皮自然风干后，称量其质量为m2，平均装样量按下式计算：平均装样量＝(m1-m2)/10s500：采集骨化三醇特征峰在该步骤中，通过hplc法采集待测骨化三醇和骨化三醇对照品的特征峰。具体的，所述hplc法的条件包括：采用下列条件进行梯度洗脱：时间(min)流动相a(v％)流动相b(v％)056444.0564410.0336715.0010030.0010031.0564440.05644其中，所述流动相a为10体积％乙腈水溶液，所述流动相b为乙腈。以及，hplc色谱柱：c18，2.7微米，4.6×150毫米或等效柱；流速：1.2毫升/分钟；进样体积：10微升；柱温：33～37摄氏度；检测波长：265纳米。发明人通过实验意外地发现，检测步骤中的hplc条件能够显著影响检测得到的骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的准确性。有鉴于此，发明人通过大量实验，从中确定了上述hplc条件，由此，可以显著提高检测得到的骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的准确性。本领域技术人员能够理解的是，上述峰面积为骨化三醇峰面积和骨化三醇异构体峰面积的加和。s600：确定骨化三醇含量在该步骤中，确定骨化三醇软胶囊中骨化三醇的含量。具体的，基于下式确定所述骨化三醇软胶囊中骨化三醇的含量：其中，aspl表示hplc法检测图谱中待测骨化三醇的峰面积；astd表示hplc法检测图谱中骨化三醇对照品的峰面积；wr表示骨化三醇对照品的重量；wc表示骨化三醇对照品储备溶液的总重量；w1表示称取的骨化三醇对照品储备溶液的重量；w2表示骨化三醇对照品溶液的总重量；p表示骨化三醇对照品的纯度；m表示软胶囊的平均装样量；lc表示所述骨化三醇软胶囊中的骨化三醇标示量，其中，所述骨化三醇对照品为已知纯度的骨化三醇；所述骨化三醇对照品储备溶液是称取已知重量的骨化三醇并溶解得到的；所述骨化三醇对照品溶液是将所述骨化三醇对照品储备溶液稀释得到的。由此，可以进一步提高检测得到的骨化三醇软胶囊中骨化三醇含量的准确性。下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。一般方法除非特别说明，在后面的实施例中采用下列方法进行hplc检测：hplc法的条件包括：采用下列条件进行梯度洗脱：时间(min)流动相a(v％)流动相b(v％)056444.0564410.0336715.0010030.0010031.0564440.05644其中，所述流动相a为10体积％乙腈水溶液，所述流动相b为乙腈。以及，hplc色谱柱：c18，2.7微米，4.6×150毫米或等效柱；流速：1.2毫升/分钟；进样体积：10微升；柱温：33～37摄氏度；检测波长：265纳米。实施例1在本实施例中，发明人按照一般方法的描述测得了空白溶液的hplc谱图，如图2所示。需要说明的是，空白溶液为辛酸癸酸甘油三酯实施例2在本实施例中，发明人按照一般方法的描述测得了分离度溶液的hplc谱图。参考图3，分离度溶液的hplc谱图中骨化三醇特征峰与骨化三醇异构体特征峰的分离度较好。实施例3在本实施例中，发明人按照一般方法的描述测得了骨化三醇对照品的hplc谱图。如图4所示。实施例4在本实施例中，发明人按照一般方法的描述测得了待测骨化三醇的hplc谱图。如图5所示。实施例5在本实施例中，发明人验证了一般方法的专属性。具体的，首先，发明人按照骨化三醇软胶囊制剂配方制备不含骨化三醇的空白软胶囊内容物，作为定位溶液，并按照一般方法的描述对其进行检测，结果表明，参考图6，hplc谱图中骨化三醇特征峰与骨化三醇异构体特征峰的出峰位置附近无杂峰干扰，即骨化三醇软胶囊中除骨化三醇及其异构体外的其他内容物对检测骨化三醇含量无影响。进一步的，发明人对待测骨化三醇样品进行强制降解处理，并按照一般方法的描述检测得了经强制降解处理后的骨化三醇样品中骨化三醇的hplc谱图。具体的，所述强制降解条件包括：强制降解条件强度时间温度正常样品无无室温酸处理5nhcl2h室温碱处理5nnaoh2h室温氧化处理3％h2o230min室温高温处理无24h80摄氏度光照处理uv250～270nm3days室温结果表明，参考图7、图8、图9、图10、图11和图12，骨化三醇在上述强制降解条件下稳定，经hplc法检测得到的谱图中未产生干扰峰。实施例6在本实施例中，发明人考察了骨化三醇在0.80μg/g～4.8μg/g浓度范围内的线性。具体的，发明人配制了浓度分别为0.80μg/g、1.6μg/g、1.92μg/g、2.56μg/g、3.20μg/g和4.80μg/g的骨化三醇待测液液，并按照一般方法的描述分别测定了骨化三醇待测液中骨化三醇的峰面积，然后用峰面积对浓度作图，得到标准曲线。结果表明，参考图13，在0.80μg/g～4.8μg/g浓度范围内的检测结果线性好。实施例7在本实施例中，发明人考察了骨化三醇检测的精密度。具体的，发明人配制了6份骨化三醇样品溶液，按照一般方法的描述分别测定了6份骨化三醇样品的峰面积，重复测定的相对偏差为0.6％。结果表明，该方法测定样品时重复性好。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12