一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及一种诊断试剂盒，具体涉及一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒。
背景技术：
：人博卡病毒1型(humanbocavirus1，HBoV1)是在儿童急性呼吸道感染样本进行大规模筛查而发现的一种新的细小病毒。自从人博卡病毒1型被报道发现以后，一些国家和地区相继报道在上、下呼吸道感染患者的呼吸道标本中检测到该病毒，证明了人博卡病毒在全世界范围内存在，该病毒的流行成为一个全球性问题。在我国，先后在浙江省、湖南省、北京市及香港地区、台湾地区等地方检测到了人博卡病毒感染的样本。容易被人博卡病毒感染的人群大多为2岁以下的婴幼儿，引起的相关呼吸道疾病主要有肺炎、支气管炎、鼻炎、咽喉炎，也有少数研究报道感染该病毒后导致结膜炎、皮疹、哮喘等。其主要临床表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸困难和发烧。针对人博卡病毒的感染，临床症状并不能有效诊断病原，其病原的确诊必需进行实验室诊断。目前己报道的关于人博卡病毒检测的研究工作均采用PCR技术和Real-timePCR扩增技术。然而，这些方法存在操作繁琐、价格昂贵等缺点。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特异性强等优点现已被广泛应用于许多病原的抗原或抗体的检测。VP2是人博卡病毒1型主要的抗原基因，也是人博卡病毒血清学诊断研究的热点。然而VP2蛋白制备难度很大，筛选能稳定而大量表达的免疫原性强的抗原基因是建立人博卡病毒感染可靠ELISA诊断方法的关键。目前还没有一种稳定而可靠的人博卡病毒血清学诊断方法，这是当前人博卡病毒防治急需解决的问题，建立快速而有效的人博卡病毒诊断方法，对于人博卡病毒的防治具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供了一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒，该试剂盒能特异性检测出人博卡病毒1型的抗体，可用于人博卡病毒1型感染后的抗体检测。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒，包括包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗。所述的抗体检测板上包被的抗原为人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白(VP2N)，其包被量优选为1μg/孔。所述的酶标二抗为羊抗人酶标二抗。所述的人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白的氨基酸序列及其编码序列分别如SEQIDNO.1、2所示。为方便使用，所述的人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒还可以包括其它的相关试剂，如洗涤液、显色液、终止液等。所述的人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白优选通过包括如下步骤的方法制备：(1)以人博卡病毒1型基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：上游引物：CGAGCTCTCTGACACTGACATTCAAGA，下游引物：CCCAAGCTTATTGCCTCCAGCTGCA。(2)将扩增的PCR产物、表达载体pET28a(+)用SacI、HindIII酶切后再连接，构建原核表达载体pET28a-VP2N。(3)用原核表达载体pET28a-VP2N转化大肠杆菌BL21(DE3)，将阳性重组菌进行诱导表达、纯化得到目的蛋白。所述的诱导、表达具体为：将阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中进行IPTG诱导表达；收集表达的宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白。本发明试剂盒中所用的包被抗原为人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白(VP2N)，VP2N是人博卡病毒1型结构蛋白VP2基因中的一段抗原性和亲水性都很强的靶序列。VP2基因编码人博卡病毒1型衣壳蛋白，目前对于VP2的研究主要集中在新型基因工程疫苗方面。经本发明试验证明，由原核表达系统表达的重组VP2N蛋白所建立的间接ELISA检测方法，能通过抗体检测特异性人博卡病毒1型感染，具有很强的实用性和推广性，有着非常广阔的市场前景。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明所采用的VP2N重组蛋白便于大量制备和纯化，VP2N基因在pET原核表达系统中可得到稳定而高效的表达，携带组氨酸标记的重组蛋白易于纯化。(2)本发明的诊断试剂盒具有很强的实用性，可用于人博卡病毒感染后的抗体检测或人博卡病毒感染的诊断。(3)本发明试剂盒结果判定方便、灵敏、准确、可靠，采用TMB底物进行显色，用酶标仪测定OD值，判定待检样品的检测结果；阴阳性结果差异明显，比OPD显色更加灵敏、可靠和稳定。(4)本发明试剂盒操作简便快速，能在1.5h内完成样品检测，耗时短，成本低，非常适合大量个体血清样品的检测。附图说明图1为VP2N基因的核酸电泳鉴定图。其中，1和2泳道为VP2N基因，M为DL2000Plus。图2为VP2N重组蛋白的表达SDS-PAGE电泳鉴定图。其中各泳道为：1：ProteinMarker，2：BSA(12μg)；3：pET28空载体对照的IPTG诱导表达；4：VP2N重组蛋白包涵体2倍稀释(上样量30μL)；5：VP2N重组蛋白包涵体5倍稀释(上样量30μL)。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11、人博卡病毒1型VP2N基因的克隆和原核表达载体的构建参考GenBank中人博卡病毒1型基因组序列(GU139423.1)设计VP2N基因片段(编码人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸截短蛋白的基因片段)的特异性引物，所用引物序列为：上游引物：CGAGCTCTCTGACACTGACATTCAAGA，下划线部分为SacI酶切位点，下游引物：CCCAAGCTTATTGCCTCCAGCTGCA，下划线部分为HindIII酶切位点。通过PCR扩增大小为630bp的VP2N特异性目的基因，酶切后与pET28a(+)表达载体连接，构建原核表达载体pET28a-VP2N，通过PCR、双酶切和测序鉴定表明，成功构建VP2N基因原核表达载体，其电泳图见图1。2、VP2N重组蛋白的高效表达和纯化将原核表达载体pET28a-VP2N转化BL21(DE3)，挑取阳性重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃振荡培养，当菌液OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达。诱导表达4小时后，离心收集大量表达的宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用0.45μm的滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组蛋白。SDS-PAGE电泳鉴定表明，VP2N重组蛋白大小约为35kD，其电泳图见图2。实施例21、ELISA抗体检测板的制备用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的VP2N重组蛋白稀释成一定浓度，按100μL/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。用PBST洗板四次，每孔加入200μL1×blockingbuffer37℃封闭1小时，用PBS洗板四次，室温晾干，装入干燥剂进行真空包装得ELISA抗体检测板，置4℃保存。2、ELISA方法操作程序(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液。(2)待检血清、VP2N抗体阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液(1×blockingbuffer)作1:100倍稀释，按每孔100μL加入ELISA抗体检测板中，37℃孵育40min，甩干。(3)每孔加入200μL洗涤液，洗涤4次，每次1min，甩干。(4)每孔加入100μL酶标二抗工作液，37℃孵育40min，甩干。(5)每孔加入200μL洗涤液，洗涤4次，每次1min，甩干。(6)每孔加入100μLTMB显色液，37℃避光孵育5min。(7)每孔加入50μL终止液，用酶标仪在630nm波长下读取光吸收值(OD630值)。上述洗涤液、1×blockingbuffer、TMB显色液、终止液等为ELISA方法的常规试剂。酶标二抗工作液为经1×blockingbuffer稀释4万倍的羊抗人酶标二抗(HRP-conjugatedAffinipureGoatAnti-HumanIgG(H+L)，PTG)。VP2N抗体阳性对照血清和阴性对照血清的制备如下：VP2N抗体阳性对照血清的制备：挑选健康的3月龄大耳白兔，尾根内侧或股内侧皮内注射0.8μg/μL的VP2N重组蛋白0.5mL，首免之后每隔2周采用相同方法进行一次加强免疫，在第四次免疫后的第5天进行颈动脉采血，分离血清，加入万分之一的硫柳汞防腐，无菌过滤。阴性对照血清为未注射VP2N重组蛋白的阴性兔血清，加入万分之一的硫柳汞防腐，无菌过滤。3、抗原包被量的优化VP2N重组蛋白按每孔0.01μg、0.03μg、0.0625μg、0.125μg、0.25μg、0.5μg、1μg和2μg的包被浓度进行方阵试验，操作同上，不同抗原包被量下阳性对照血清、阴性对照血清的OD630值见表1。方阵试验表明抗原的最佳包被浓度是1μg/孔。表14、检测结果的判定标准对36份的阴性人血清样品进行抗体检测，检测结果(OD630值)见表2。通过计算阴性平均值与标准差(X+2SD)得到该ELISA检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义待检样品的判定标准为：当待检样品OD630≥0.29判定为阳性；OD630≤0.24时样品判为阴性；当0.29＞OD630＞0.24时判为可疑，此时样品需复检一次，若OD630≥0.27判定为阳性，OD630≤0.27则判为阴性。表20.2250.2030.2340.2290.2290.2420.2520.2470.2310.2560.2390.2310.2650.280.2730.2620.2670.2660.2290.2290.2420.2750.270.2840.2520.2470.2310.2680.2560.2730.2650.280.2730.2480.2510.2585、临床血清检测对收集的24份临床人血清样本进行PCR检测，共检出4份人博卡病毒感染阳性样本，对该4份血清经ELISA诊断试剂盒检测，检测结果(OD630值)见表3，与PCR检测结果相符，试验表明，本发明的ELISA诊断方法特异性强，结果稳定可靠，可特异性地检测出人博卡病毒抗体。表3样本123456OD6300.3040.3063330.3026670.3476670.2150.628表3中1-4为人博卡病毒感染阳性样本，5、6分别为VP2N抗体阴性对照血清和阳性对照血清。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3