一种高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法与流程

本发明属于畜牧领域，尤其是涉及一种高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法。
背景技术：
：铁是动物生长发育所必须的微量元素，是动物体内多种酶的组成部分。猪缺铁性贫血是由于猪在生长过程中缺铁引起血液中红细胞数、血红细胞浓度下降。猪的生理特性决定了猪是所有动物中最易发生缺铁性贫血症的动物。当发生缺铁性贫血症时可造成猪的血液携氧能力严重不足，新陈代谢紊乱，抗应激能力下降，从而引发各种疾病。缺铁性贫血多发生天生长快、个体比较壮的仔猪。葡庚糖酐铁是临床使用效果较好的一种补铁剂，仔猪注射葡庚糖酐铁后红细胞数、血红蛋白、血清铁蛋白显著增加，与一般补铁剂相比，葡庚糖酐铁吸收快，铁的利用率高，注射量少，副作用小，是治疗仔猪缺铁性贫血的有效药物。葡庚糖酐铁，英文名：Gleptoferron，CAS号为57680-55-4，分子式为C13H25FeO15，分子量477.1741，棕色至棕褐色结晶性粉末，易溶于热水，不溶于乙醇。结构式见图1。技术实现要素：有鉴于此，本发明旨在提出一种高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法，高效、简便、灵敏度高、分离效果好、准确度高。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法，该方法采用Agilent1220高效液相色谱仪，采用蒸发光散射检测器，漂移管温度70℃，气体流速1.7L/min，自动进样器进样量10μl，包括如下步骤：(1)色谱条件：色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱，流动相为乙腈-0.5mol/L磷酸二氢钠溶液，其中，乙腈与0.5mol/L磷酸二氢钠溶液的体积比为26:74，流速1.0ml/min，柱温35℃；(2)标准曲线绘制：精密称取对照品25mg，置于50ml棕色容量瓶中，加入40ml纯净水超声使其全部溶解，放冷后定容至刻度，作为葡庚糖酐铁标准溶液储备液，逐级稀释制成葡庚糖酐铁含量为5、10、20、50、100、200、500μg/ml的溶液，分别按所述的步骤(1)的色谱条件测定，色谱柱色谱柱10μl，分别计算相同保留时间下的峰面积，以含量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，做出标准曲线方程Y＝f(X)，含量在5-500μg/ml范围；(3)样品处理：精密称取供试品适量，用水稀释制成适当浓度的溶液，摇匀，用0.45μm有机滤头过滤；(4)检测待测葡庚糖酐铁样品中葡庚糖酐铁的含量：将经过处理的待测葡庚糖酐铁样品注入所述的步骤(1)设置的色谱条件测定，色谱柱进样量10μl，计算相同保留时间下的峰面积，带入所述的步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出上机待测葡庚糖酐铁样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出样品中葡庚糖酐铁的含量。进一步，所述的色谱柱选择WatersC18柱4.6*250mm，5μm或WatersC18柱4.6*150mm，5μm；优选的，所述的色谱柱选择WatersC18柱4.6*250mm，5μm。相对于现有技术，本发明所述的高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法具有以下优势：本发明所述的高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法经过精密度试验、线性关系试验和加样回收试验等对方法进行了验证，结果表明该方法准确可靠，检测范围大，灵敏度和准确性高。附图说明构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为葡庚糖酐铁的结构式；图2为本发明实施例所述的葡庚糖酐铁对照品的HPLC检测谱图；图3为本发明所述的葡庚糖酐铁的线性关系图与回归方程。具体实施方式除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。下面结合实施例来详细说明本发明。一种高效液相色谱测定葡庚糖酐铁含量的方法，该方法采用Agilent1220高效液相色谱仪，采用蒸发光散射检测器，漂移管温度70℃，气体流速1.7L/min，自动进样器进样量10μl，包括如下步骤：(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为色谱柱，选用WatersC18柱(4.6*250mm，5μm)，流动相是乙腈-0.5％磷酸二氢钠溶液(V/V，26:74)，流速1.0ml/min，柱温35℃，采用蒸发光散射检测器，漂移管温度70℃，气体流速1.7L/min，自动进样器进样量10μl；(2)标准曲线的绘制：精密称量精密称取对照品25mg，置于50ml棕色容量瓶中，加入40ml纯净水超声使其全部溶解，放冷后定容至刻度，作为葡庚糖酐铁标准溶液储备液，逐级稀释制成葡庚糖酐铁含量为5、10、20、50、100、200、500μg/ml的溶液，分别注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱10μl，分别计算相同保留时间下的峰面积，以含量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，做出标准曲线方程y＝585588x-200000，R2＝0.9995，结果表明葡庚糖酐铁含量在5-500μg/ml范围内，峰面积与浓度呈以上关系；(3)检测待测葡庚糖酐铁注射液的含量：精密称取待测葡庚糖酐铁注射液，加水溶解，制成适当浓度，摇匀，经0.45μm有机滤头过滤。注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱10μl，计算保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算出上机待测葡庚糖酐铁样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出葡庚糖酐铁的含量，葡庚糖酐铁含量的计算方法如下：样品中葡庚糖酐铁含量(％)＝待测葡庚糖酐铁样品溶液的浓度/(待测葡庚糖酐铁取样重量*稀释因子)*100％葡庚糖酐铁(％)＝样品中葡庚糖酐铁含量/葡庚糖酐铁制剂标示量*100％根据上式，计算出葡庚糖酐铁为标示量含量的100.9％(稀释因子为样品稀释倍数的倒数)；(4)精密度考察：对同一葡庚糖酐铁注射液样品，连续进样6次，峰面积如下表1：表1葡庚糖酐铁注射液样品的峰面积进样次数123456峰面积272726012727490127266218272737242726532227261197峰面积RSD为0.02％，结果表明，本HPLC法检测葡庚糖酐铁含量精密度高，重现性好；(5)加样回收试验准确称取已知含量的葡庚糖酐铁样品适量，再分别精密加入一定量的葡庚糖酐铁样品80％、100％、120％，使供试品溶液中的葡庚糖酐铁浓度分别在葡庚糖酐铁标准曲线的低、中、高区域，按本发明的操作，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99.64％，RSD为0.08％，表明该方法加样回收率好。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3