用于将组织样品包埋进包埋介质的方法和自动化机器与流程

本发明涉及一种将组织样品包埋进包埋介质的方法。

本发明进一步涉及一种用于执行这种方法的自动化机器，并涉及在执行该方法中包含具有基座的容器并包含用于将至少一种组织样品保持在所述基座上的保持元件的组织匣盒的用途。

背景技术：

为了组织学研究而对生物组织样品进行处理的方式是已知的。首先，完成对组织样品的修剪并将其引入匣盒。然后以多种化学处理的方式处理样品以用于微观研究。关于这点，首先用固定介质固定样品，去除样品中存在的水分，并且任选地完成其它处理步骤。在这种多步骤工艺结束时进行了渗透介质(通常为石蜡)渗透到样品中。

然后，通常以手工方式将样品包埋进包埋介质，例如石蜡。为此，将样品放入模子，并且该模子填充有初始液态包埋介质。然后包埋介质变硬。结果是产生了由包埋介质以固定的方式将样品环绕并固定化的包埋块。

在包埋介质变硬后，利用显微镜用薄片切片机可以将含有样品的包埋块切片为单独的薄薄的样品切片，在随后的步骤中对该样品切片进行染色，然后利用显微镜可以对其进行研究。对于这一目的，重要的是组织样品在包埋块中具有特定方向，特别地，以确保进行适当切片并确保可以将组织样品沿着显微研究所感兴趣的样品层进行切片。

为了使包埋工艺自动化，有必要将组织样品在包埋操作过程中保持在其相对于成型容器的预期方向。如果采用了将组织样品保持在其方向的保持元件，存在有必要将保持元件与组织样品一起包埋的问题，而该问题妨碍了样品切片的后续产生和/或甚至损坏显微镜用薄片切片机刀片。

EP 2 322 938 B1公开了配备为用于对被布置在非常特殊载体上的组织样品进行包埋的自动化机器。该载体适合于与包埋样品一起利用显微镜用薄片切片机进行切片。该机器包含若干个不可移动的保持件，各个保持件配备为在整个包埋操作中保持特殊载体的一个。一旦将具有样品的载体定位于保持件中，用从分配器传输而来的包埋介质对载体进行填充。然后，由为了实施其它功能也配备为冷却单元的载体对载体进行冷却。

代替可切片的载体，还可以采用诸如由DE 10 2013 204 651 A1所知晓的特殊组织匣盒。该文件描述了其中无需特殊可切片载体的包埋工艺。在该包埋工艺中，将石蜡倾倒入组织匣盒，并继而将组织匣盒保持在紧靠冷却表面，从而使得位于组织匣盒底部的石蜡开始冷却。由于这个区域的石蜡冷却，经过固化的石蜡的第一薄层将组织样品粘附至基座。当剩余石蜡仍然为熔融态时，收缩部件将第一组织接合表面从组织样品拉走。

DE 10 2013 204 651 A1具体公开了用于保持组织样品的组织匣盒，其包含具有第一组织结合表面的保留部件，和至少一个预加载元件。由于预加载元件，将第一组织接合表面可移动地安装在保留部件上。基座包含第二组织接合表面，并且配备为其与保留部件接合以配备内部空间区域，第一组织接合表面和第二组织接合表面面向彼此。预加载元件被配置为其将第一组织接合表面推向第二组织接合表面，从而将组织样品保留在它们之间的内部空间区域。收缩部件与保留部件连接，并配备为收缩部件缩回第一组织接合表面并压紧预加载元件，以便在组织样品和第一组织接合表面或第二组织接合表面之间形成间隙。

然而这种组织匣盒的使用在实践中并不是没有问题的，因为可能发生事实上可引起组织样品变得无法使用的大量干扰现象。例如，可能发生的是组织样品在收缩操作的情况下被不经意间地移动或损坏，或者甚至可能发生的是组织接合表面无法充分缩回或根本不能缩回。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是描述可以以自动化方式执行的、并且能够使其中组织样品显示出预定方向的包埋块可靠地生成。

该目的由以以下步骤为特征的方法实现：

a.利用将组织样品压在容器的基座上的保持元件而将组织样品以预定方向保持在容器中；

b.将具有高于64摄氏度、特别是范围在65摄氏度至67摄氏度的温度，或66摄氏度的温度的液体包埋介质倾倒入容器中；

c.对容器的基座进行冷却；

d.执行分离运动，通过分离运动组织样品和保持元件远离彼此移动，在分离运动过程中保持元件通过其移动的包埋介质的那些层在分离运动过程中具有范围在54摄氏度至64摄氏度、特别地为60摄氏度的温度，和/或与保持元件直接相邻的包埋介质的那些部分在分离运动过程中具有范围在54摄氏度至64摄氏度、特别地为60摄氏度的温度。

本发明具有一方面总是确保将组织样品保留其相对于容器的方向，并且另一方面同时保证保持元件可以无需粘在包埋介质中并且无需改变组织样品位置或甚至损坏组织样品的情况下进行移动的非常特别的益处。

根据本发明已被认可的是与经过冷却的基座相邻的包埋介质的那些部分已经变硬至足以将组织样品保持在其位置和方向，如果保持元件位置处的包埋介质的温度仍然在54摄氏度至64摄氏度的范围内，特别为60摄氏度，从而可以将保持元件从组织样品移除。在该温度范围内，包埋介质还具有足够的流动性从而在无破坏的情况下，并且特别地在不影响组织样品的位置或方向、或损坏组织样品、或对硬化工艺质量产生不利影响的情况下，使保持元件移除。特别地，可以有益地提供：在执行分离运动过程中包埋介质具有范围在54摄氏度至64摄氏度的平均温度，特别地为60摄氏度的平均温度。

在以上叙述的温度下执行各个方法步骤是有益的，特别是当将石蜡用作包埋介质时，特别是当石蜡具有范围在50摄氏度至60摄氏度的滴点时。如果采用了具有不同滴点的包埋介质，可以对执行各个方法步骤的温度进行相应调整。

特别地，可以有益地提供：一旦直接与基座相邻的包埋介质的层达到52摄氏度的温度即可启动分离运动，特别地自动地启动分离运动。根据本发明已经认识到当保持元件位置处的包埋介质的温度在54摄氏度至64摄氏度的范围内、特别是60摄氏度时就是这种情况。

一旦分离运动被完全执行，使包埋介质冷进一步冷却直到其完全变硬，并且可以从容器中移除所获得的包埋块。

在特别有益的实施方式中，不将保持元件完全从包埋介质移除。分离运动相反可以有益地结束，而保持元件仍然位于包埋介质内。因此也对保持元件进行包埋。这种实施方式具有非常特别的益处，即保持元件给予由对包埋介质进行冷却而得到的包埋块额外的机械稳定性。结果是有益地防止包埋块在随后的夹紧和/或在用显微镜用薄片切片机进行切片时被不经意间变形。为了夹紧，可以采用连接至保持元件并且伸出包埋块的突起。然而，通过分离运动已经将保持元件从组织样品移开的事实同时有益地确保了在产生组织切片时无需对稳定保持元件进行切割。

本发明不限于在各种情况下包埋单个组织样品。相反，还可能以所描述的方式将若干组织样品同时包埋在相同容器中。当本申请的上下文中指出对“组织样品”进行包埋，这仅当作对本发明更简单的说明而无意与任何限制相关联。

包埋介质可以，例如，为石蜡或可以含有，特别地主要含有，石蜡。

在非常特别有益的方法的实施方式中，包埋介质(特别是当其为具有范围在50摄氏度至60摄氏度的滴点的石蜡)在倾倒时具有高于64摄氏度的温度。这确保了包埋介质在其冷却前填充容器内的整个可用空间。65至67摄氏度范围的倾倒温度，特别是66摄氏度的温度，是特别有益的。该温度确保了组织样品的所有侧面都被包埋介质可靠地围绕。此外，在基座的区域中包埋介质变硬所需的时间间隔，以及随后在其余区域中完全变硬所需的时间间隔是特别短的。因此实现了高吞吐率，从而每单位时间可以包埋特别大量的组织样品，例如通过自动化机器。

对于不同类型的包埋介质，滴点可以不同。例如，存在滴点在52摄氏度至58摄氏度范围的包埋介质，其描述于例如DE 10 2009 035 019 A1中。因此，通常特别有益的是如果在倾倒时包埋介质具有比包埋介质的滴点高了至少4摄氏度的温度。特别地，可以有益地提供：在倾倒时包埋介质具有比包埋介质的滴点高了5至7摄氏度的温度，和/或比包埋介质的滴点高了6摄氏度的温度。例如，可以倾倒入滴点为55摄氏度的包埋介质，特别地，在61摄氏度的温度下。

如以下通过举例的方式将进行说明的，存在关于如何以及特别是何时可以开始分离运动的各种可能性。

例如，可以有益地提供：当达到包埋介质或容器或保持元件的预定或可预定启动温度时，(特别是自动地)启动分离运动。为了这个目的，例如，可以直接用温度传感器测量温度。可选地，还可以以另一参数来推断温度，以便由此确定是否已经达到启动温度。特别地，可以以自对基座的冷却操作开始的时间间隔的方式推断包埋介质或容器或保持元件的温度。特别地，此处在执行本方法前可以已经进行了校准测量，从而确定启动温度在其后出现的时间段。特别地，时间段的长度可以依赖于容器的性质和尺寸并且依赖于包埋介质的性质。

移动保持元件的保持机构还可以包含至少一种形状记忆部件。形状记忆部件有益地配备为一旦形状记忆部件在启动温度，其就自动缩回保持元件。

保持元件可以有益地配备为，例如，筛。以这种方式配备的保持元件具有包埋介质可以在分离运动中流经筛口的益处。因此有益的结果为分离运动中在很大程度上避免可对组织样品的方向产生不利影响的包埋介质中的湍流。此外，这种实施方案具有的益处为对分离运动呈现较小的阻力并且粘住保持元件的风险降低。

可以以各种各样的方式移动保持元件以执行分离运动。例如，可以利用磁铁对保持元件施力。为了这个目的，保持元件可以至少部分由磁性材料制成。还可以利用夹持件水平和/或垂直移动保持元件。该夹持件可以配备为，例如，钩在保持元件上以执行分离运动的挂钩。如已经提及的，可以提供：为了执行分离运动，利用包含(例如基于记忆聚合物的)形状记忆部件的保持机构使保持元件移动。

如已经提及的，可以有益地提供，采用冷却开始的时间点为时间基准，并且在冷却开始后的预定或可预定时间段期满后立即开始分离运动，和/或在冷却开始后的预定或可预定时间段期满后立即自动开始分离运动。当开始冷却和开始分离运动之间的时间段在1秒至4秒的范围或在2秒至3秒的范围时获得特别好的结果。

特别地，在完成分离运动前，在对包埋介质进行冷却和逐渐固化中，为了确保保持元件没有被不经意间停止，应在预定或可预定时间窗内进行分离运动和/或分离运动应持续预定或可预定时间段。当时间窗为17至20秒长时和/或时间段持续了17至20秒时获得特别好的结果。

例如，通过使容器与冷却元件进行导热接触的事实，可以有益地实施对容器基座的冷却。冷却元件可以为，例如，将容器放置于其上的冷却板。

为了实施本方法，例如可以首先将包埋介质倾倒入容器，并继而例如通过实现与冷却板的接触而对容器的基座进行冷却。在该实施方式中，可以将实现接触的时刻作为时间段期满后开始分离运动的时间段的开始时间点。可选地，还可以例如通过实现与冷却板接触而对基座上的容器进行冷却，并继而将包埋介质倾倒入其中。在这种情况下，可以将倾倒的时间点，特别是倾倒操作结束的时间点，用作为时间段期满后开始分离运动的时间段的开始时间点。

在非常特别有益的实施方式中，只在基座处对容器进行冷却。该实施方式具有非常特别的益处，即有效地避免了经过冷却的包埋介质中的应力开裂。

如已经提及的，根据本发明的方法可以特别地用于对组织样品进行自动化处理。为此，特别地可以同时对保留在多个容器中的多个组织样品进行包埋，在多个容器中多个组织样品被保持在它们各自的目标方向。为此，例如，可以将若干容器分别保留在共有的保持件中，例如以矩阵的方式和在一个平面上共面的方式。例如，可以容易地将该保持件放置在冷却板上，以便同时分别对若干容器在其基座进行冷却。然而，还可以例如采用在其中以堆叠方式布置容器的保持件。以这样的实施方式，例如，可以提供若干冷却指，该冷却指与容器之间的间隙相配合，以便在其基座从下方对各个单独的容器进行冷却。采用若干容器的保持件具有的益处为通过处理共有的保持件自动化机器可以同时传输若干容器，用包埋介质同时对它们进行填充，并同时对它们进行冷却；这提高了吞吐率。

特别地，根据本发明的方法还可以是用于处理组织样品或若干组织样品的高阶方法的构成，在该方法中，除了包埋之外，还执行了先前或后续的其它工艺步骤。该其它工艺步骤可特别地包含在包埋前以至少一种固定试剂固定组织样品，和/或将至少一种渗透介质(特别地为石蜡)渗透到组织样品中。

此处可以特别地提供，还可以在将组织样品在容器中布置成预期方向后实施其它工艺步骤。因此在包埋过程中和至少一个先前的其它工艺步骤过程中组织样品保持在相同的容器中，直到其被完全包埋。

特别有益地是采用包含具有基座的容器并且包含用于将至少一个组织样品保持在基座上的保持元件的组织匣盒，以执行根据本发明的方法。

附图说明

附图中示意性地并以实施例的方式描绘了本发明的主题，并且以下将参考附图对本发明的主题进行描述，通常以相同的参考符号标记相同的元件或者功能相同的元件。

图1至图5示出依据根据本发明方法的示例性实施方案的步骤；以及

图6是倾倒入容器中的包埋介质的温度随时间的变化的图示，以及实施根据本发明方法的示例性实施方案的情况下的相关时间段的图示。

部件列表：

1.组织样品

2.容器

3.保持元件

4.基座

5.包埋介质

6.冷却元件

t₁第一时间段

t₂第二时间段

具体实施方式

图1示出用于实施根据本发明方法的示例性实施方式的第一步骤的情况下的情形。利用将组织样品1压在容器2的基座4上的保持元件3将组织样品1以预期方向保留在容器2中。保持元件3可以被配备为，例如，弹簧加载的筛。将组织样品1夹在保持元件3与基座4之间的事实确保了组织样品1保留其预期方向。

在接下来的步骤中，将特别地可以为石蜡并且具有高于64摄氏度、特别是范围在65摄氏度至67摄氏度的温度，或66摄氏度的温度的液体包埋介质5倾倒入容器中，如图2所示。在该步骤中，保持元件3将组织样品1连续地保持在其位置和预期方向。

在接下来的步骤中，通过使基座4与冷却元件6接触而完成对容器2的基座4的冷却，这在图3中示出。在这个实施例中，冷却元件6被配备为将容器2放置在其上的冷却板。同样在该步骤中，保持元件3将组织样品1连续地保持在其位置和预期方向。

保持元件3所位于其中的包埋介质5的层一旦具有范围在54摄氏度至64摄氏度、特别是60摄氏度的温度，开始分离运动，通过分离运动将组织样品1和保持元件3远离彼此移动，这被描述在图4中。在这种情形下，基座区域的包埋介质5已经冷却，并因此变硬，足以将组织样品1保持在其位置和方向，从而利用保持元件3的保持已变得不必要。为了确保保持元件3在完成分离运动前在使包埋介质5冷却并逐渐固化过程中不被粘住，在17至20秒的预定时间窗内完成分离运动。

然后可以继续对包埋介质5进行冷却直到完全被硬化，并且可以将所获得包埋块与被包埋的组织样品1一起从容器2移除。

图6示出了开始对基座4进行冷却(t＝0)后在保持元件3的区域内包埋介质5的温度随时间的变化，该包埋介质5首先具有66摄氏度的温度，并且示出了在实施根据本发明方法的示例性实施方式的情况下的相关时间段。

在这个示例性实施方式中，在冷却开始(t＝0)的第一时间段t₁期满后立即开始分离运动。当第一时间段t₁在1秒至4秒的范围或在2秒至3秒的范围时获得特别好的结果。

特别地，为了确保在完成分离运动前在使包埋介质5冷却和逐渐固化过程中保持元件3不会被不经意间固定化，应在第一时间段t₁后随即的第二时间段t₂内进行并且完成分离运动。当第二时间段t₂为17至20秒长时获得特别好的结果。