一种基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器的制作方法

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器检测胆碱的方法。

背景技术：

胆碱是一种有机碱，是乙酰胆碱的前体和卵磷脂的组成成分，也存在于神经鞘磷脂中。胆碱在调整动物体内脂肪代谢、控制胆固醇的积蓄、防止脂肪肝、保证体细胞的正常生命活动、促进软骨发育以及神经系统的正常运行等方面都起着重要作用，其检测具有重要的生物学意义。

由于胆碱没有紫外吸收和电化学活性，所以利用酶的催化反应成为测定胆碱的重要方法。多数胆碱传感器使用过氧化物酶，同时借助于电子媒介物或纳米材料。酶的使用可以使传感器的选择性得以保证，但是酶的固定方法和其活性依然是一个需要继续研究的问题。此外，引入媒介物可以使传感器的性能大大提高，但同时也引入了复杂性和局限性。目前用于人体血清中胆碱浓度检测的生物传感器已有报道，但是由于抗干扰性差、线性范围窄、使用寿命短等不足之处，它们在临床检测应用上受到限制。

因此，发展一种选择性好、电极结构简便、成本低廉的新型胆碱传感器将具有重要的研究意义和广阔的市场价值。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种选择性好、电极结构简便、成本低廉的胆碱检测方法，本发明的方法基于双极电极阵列-微流控芯片构成的可视化电化学发光传感器。

本发明的技术方案为：

一种基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器的制备方法，包括步骤：

1)制备盖片

PDMS单体与固化剂混合而成的PDMS母液脱气后倒在硅烷化的PDMS阳模上方平衡，然后盖上保鲜膜，加热固化；固化后，将PDMS从硅烷化的PDMS阳模上剥离，得含有通道凹槽的PDMS盖片；在PDMS盖片通道两端各加工一个孔道，用于进样和放置驱动电极；

2)制备基片

A.ITO双极电极基片的制备

在ITO导电玻璃的导电表面涂5-15微米厚的正光胶胶层，将激光照排机绘制好的光刻掩膜与涂有正光胶胶层的ITO导电玻璃紧密贴合，然后进行汞灯曝光，曝光后将导电玻璃置于0.5-1wt％的NaOH溶液中显影至电极图案完全显现后取出导电玻璃，清洗，干燥；继续将导电玻璃置于硝酸与盐酸的混合水溶液中刻蚀，刻蚀完毕后，清洗，干燥，得表面刻有三根ITO双极电极的基片；

B.制备胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合物

壳聚糖溶于0.5-2wt％的醋酸水溶液中，得5-15mg/mL的壳聚糖溶液，加入多壁碳纳米管并均匀分散于壳聚糖溶液中得黑色悬浊液，碳纳米管的加入量为1-3mg/mL；取浓度为3-8mg/mL的胆碱氧化酶溶液与所述黑色悬浊液按照体积比1∶1-3混合，得胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合材料的混合液；

C.ITO双极电极的表面修饰

用疏水胶带在所述ITO双极电极的阳极端上贴一个用于防止修饰材料溶液扩散的矩形区域，移取10-30微升胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖溶液滴于矩形区域表面；将基片置于4℃冰箱内，过夜干燥以形成胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合物薄膜修饰的ITO双极电极；

3)芯片封合

清洗上述制备的基片和盖片，将基片上三根ITO双极电极对准盖片通道凹槽的中部，然后紧密贴合，得胆碱电化学发光传感器芯片。

作为优选方案，步骤1)中，PDMS母液中PDMS单体与固化剂的质量比为8∶1-12∶1；PDMS母液脱气前于4℃环境下放置5-20min；脱气时间为20-40min。

作为优选方案，步骤1)中，PDMS母液在硅烷化的PDMS阳模上方平衡时间为5-15min。

作为优选方案，步骤1)中，PDMS盖片通道两端的孔道均为圆形孔道。

作为优选方案，步骤2)中，在ITO导电玻璃表面涂正光胶之前，对ITO导电玻璃进行预处理；所述预处理具体为将ITO导电玻璃置于0.8-1.2M NaOH的乙醇溶液中浸泡过夜，之后分别在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗10-20min，将干净的ITO导电玻璃用氮气吹干。

作为优选方案，步骤2)A中，用胶头滴管吸取正光胶后均匀滴涂在ITO导电玻璃的导电表面，采用甩胶机在400-600rpm转速下匀胶，然后在2500-3500rpm转速下转动30-50s甩胶；之后将ITO导电玻璃置于105-115℃环境下烘干，然后于25-30℃的热板上缓慢冷却至室温，形成厚度均匀的正光胶胶层。

作为优选方案，步骤2)A中，汞灯曝光的时间为2-6min；将导电玻璃置于硝酸与盐酸的混合水溶液中刻蚀6-15min，其中，硝酸与盐酸的混合水溶液中，硝酸、盐酸与水的质量比为2-3∶4-6∶4-6。

采用所述基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器检测胆碱的方法，在盖片两端的孔道上分别放置一根铂丝，作为驱动电极；驱动电极通过直流稳压电源提供驱动电压；向通道凹槽内注入含有待测胆碱溶液和鲁米诺的缓冲溶液；双极电极表面修饰的胆碱氧化酶催化溶解氧与胆碱反应生成H₂O₂，并在外加电压的驱动下，与鲁米诺发生电化学发光，产生的电化学发光信号通过胆碱电化学发光传感器芯片上方的CCD图像传感器捕获；根据CCD图像传感器捕获的发光信号强度确定待测胆碱溶液中的胆碱浓度。

作为优选方案，向通道凹槽内注入15-30微升含有待测胆碱溶液和鲁米诺的缓冲溶液；所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；含有待测胆碱溶液和鲁米诺的缓冲溶液中PBS的浓度为0.05-0.15mol/L，pH为7.2-7.5；胆碱的浓度为0.01mM-1mM；鲁米诺的浓度为1.2-1.4mmol/L。本发明检测所用溶液体积仅为15-30微升，可实现微量检测，极大的提高了检测灵敏度，并降低了检测成本。

作为优选方案，所述驱动电压为4.0-9.0V。电压过高可能ITO膜会被破坏，因此电压选择该范围。

本发明的构思是：

以胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合膜修饰的ITO双极电极为传感界面，通过微流控芯片系统、铂丝驱动电极、直流稳压电源和CCD图像传感器实现胆碱的可视化电化学发光检测。驱动电极通过直流稳压电源提供驱动电压。向胆碱电化学发光传感器芯片通道凹槽内注入待测胆碱溶液和含有鲁米诺的缓冲溶液，双极电极表面修饰的胆碱氧化酶可催化溶解氧与胆碱反应生成H₂O₂，并在外加电压的驱动下，与鲁米诺发生电化学发光。产生的电化学发光信号由传感芯片上方的CCD图像传感器捕获。在一定范围内，胆碱浓度越高，酶促反应生成的过氧化氢越多，相应的发光信号也越强，由此可以实现胆碱的可视化检测。

本发明可视化电化学发光传感器检测胆碱的测定原理为：

双极电极阳极端修饰膜上的催化反应：

胆碱与氧气在胆碱氧化酶的作用下生成三甲基甘氨酸与双氧水；

双极电极阳极端的电化学反应：

Luminol+H₂O₂→3-Aminophthalate+hv

鲁米诺与双氧水反应生成3-氨基-邻苯二甲酸二甲酯并伴随发光；

双极电极阴极端的电化学反应：

4H₂O+4e^-→2H₂+4OH^-

本发明基于胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖修饰电极、双极电极及微流控芯片技术，利用电化学发光成像来实现胆碱的可视化检测。由于双极电极是一种不需要外部电接触即可在其末端发生电化学反应的导电材料，这种特性使其便于进行大量阵列分析，利于大批量生产，从而降低检测成本。

采用的电化学发光成像技术具有灵敏度高、光路简单等优点，用于胆碱的可视化检测，方法简便、结果直观。

本发明中电极修饰材料胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖，胆碱氧化酶胆碱氧化酶、碳纳米管、壳聚糖缺一不可，有胆碱氧化酶才能有催化反应产生过氧化氢，进而和鲁米诺发生发光反应；碳纳米管是为了促进电化学反应，没有碳纳米管电化学反应受阻，所以也没有光产生；壳聚糖为成膜材料，如果没有壳聚糖，胆碱氧化酶、碳纳米管溶液无法稳定地贴在电极表面。

本发明的有益效果为：

本发明制备方法简单方便，胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合膜能使胆碱氧化酶固定在电极表面，有较好成膜性和生物相容性；碳纳米管促进电子传递作用，壳聚糖促进成膜；该传感器具有特异性好、灵敏度高、选择性的优点，且所用的材料廉价易得。

开放式双极电极由于没有外部电接触，位于一个微通道中，发光试剂和被检测物可混合在一个溶液里，可进行大规模阵列分析，快速高通量检测胆碱。

微流控芯片结构简单，制备简单，成本低廉，集成微型，利于大批量生产，大大降低检测成本，有望应用于胆碱试纸的开发。

电化学发光成像技术的高灵敏度，时间空间分辨，简化的光学器件，和视觉成像能力可视化，为检测胆碱的含量提供了一项灵敏、简便且直观的微量检测方法。

该制备方法可以推广到其他类型酶，用于其他生化分子的检测，可开发出多成分检测的双极电极传感器。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器的装置及反应原理示意图；

图2为本发明ITO双电极阵列的结构示意图；

图3为本发明ITO双电极阵列芯片的加工示意图

图4是本发明胆碱检测的电化学发光图；其中，a对应浓度0mM；b对应浓度0.02mM；c对应浓度0.05mM；d对应浓度0.1mM；e对应浓度0.5mM；f对应浓度1.0mM；g对应浓度2.0mM；h对应浓度5.0mM。

图5是本发明胆碱检测的线性图。

具体实施方式

实施例1基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器的制备

如图1、图2、图3所示，一种基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器的制备方法，包括步骤：

1)制备盖片

将PDMS单体与固化剂以8∶1-12∶1的质量比混合并搅拌均匀得PDMS母液，将PDMS母液于4℃环境下放置5-20min，然后脱气2040min；脱气后倒在硅烷化的PDMS阳模上方平衡5-15min，然后盖上保鲜膜，70-80℃加热固化1-2小时；固化后，将PDMS从硅烷化的PDMS阳模上剥离，剪成3.0cm*1.2cm的盖片，该盖片上含有通道凹槽；用14G的平口针头在PDMS盖片通道两端各加工一个直径为0.5cm的圆形孔道，用于进样和放置驱动电极；

2)制备基片

A.有三根ITO双极电极基片的制备

将ITO导电玻璃切割成3.0cm*1.2cm的小片；将切割好的ITO导电玻璃置于0.8-1.2M NaOH的乙醇溶液中浸泡过夜，之后分别在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗10-20min，将干净的ITO导电玻璃用氮气吹干；用万用表确定导电面，导电面朝上置于甩胶机圆盘上；用胶头滴管吸取AZP4620正光胶后均匀滴涂在ITO导电玻璃的导电表面，在400-600rpm转速下匀胶，然后在2500-3500rpm转速下转动30-50s甩胶；待在ITO导电玻璃的导电表面涂5-15微米厚的红色光胶层后，将ITO导电玻璃置于105-115℃环境下烘干，然后于25-30℃的热板上缓慢冷却至室温，形成厚度均匀的正光胶胶层。

将激光照排机绘制好的光刻掩膜与涂有正光胶胶层的ITO导电玻璃紧密贴合，然后进行选择性汞灯曝光2-6min，曝光后将导电玻璃置于0.5-1wt％的NaOH溶液中显影至电极图案完全显现后取出导电玻璃；在去离子水中清洗除去残余的显影液，随后用吹风机吹干导电玻璃，然后在110℃热板下烘30min，烘烤结束将热板温度调至20-25℃，在热板上缓慢降至室温。

继续将导电玻璃置于硝酸与盐酸的混合水溶液(硝酸、盐酸与水的质量比为2-3∶4-6∶4-6)中刻蚀6-15min，刻蚀完毕后，依次用去离子水、丙酮、去离子水超声清洗各10min，干燥，得表面刻有三根ITO双极电极的基片；

B.制备胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合物

壳聚糖溶于0.5-2wt％的醋酸水溶液中，超声溶解，得5-15mg/mL的壳聚糖溶液，加入多壁碳纳米管并超声分散于壳聚糖溶液中得黑色悬浊液，碳纳米管的加入量为1-3mg/mL；取浓度为3-8mg/mL的胆碱氧化酶溶液与所述黑色悬浊液按照体积比1∶1-3混合，超声溶解，得胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合材料的混合液，4℃保存；

C.ITO双极电极的表面修饰

用疏水胶带在所述ITO双极电极的阳极端上贴一个用于防止修饰材料溶液扩散的矩形区域，移取10-30微升胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖溶液滴于矩形区域表面；将芯片置于4℃冰箱内，过夜干燥以形成胆碱氧化酶/碳纳米管/壳聚糖复合物薄膜修饰的ITO双极电极；

3)芯片封合

将修饰好的盖片和基片分别置于等离子体清洗室内，各处理90秒和25秒。将基片上三根ITO双极电极对准盖片通道凹槽的中部，然后紧密贴合，得胆碱电化学发光传感器芯片。

实施例2基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器用于胆碱的检测

采用基于双极电极阵列的可视化胆碱传感器检测胆碱的方法，在盖片两端的孔道上分别放置一根铂丝，作为驱动电极；驱动电极通过直流稳压电源提供8V的驱动电压；向通道凹槽内注入20微升含有待测胆碱溶液和鲁米诺的缓冲溶液，其中，PBS的浓度为0.01mol/L，pH为7.4，胆碱的浓度为0.02mM-5mM，鲁米诺的浓度为1.3mmol/L；双极电极表面修饰的胆碱氧化酶催化溶解氧与胆碱反应生成H₂O₂，并在外加电压的驱动下，与鲁米诺发生电化学发光，产生的电化学发光信号通过胆碱电化学发光传感器芯片上方的CCD图像传感器捕获；根据CCD图像传感器捕获的发光信号强度确定待测胆碱溶液中的胆碱浓度。

分别对0mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM和5.0mM系列浓度的胆碱进行检测，检测结果如图4和图5所示；本发明方法检测胆碱的最低检出限为43.19μM；随着胆碱浓度的升高，发光图像的灰度值也逐渐增大。通过线性拟合可知，灰度值与胆碱浓度在0.02-5.0mM范围内有着良好的线性关系。所得拟合方程为：

G＝1022+212.2[choline](mM)(R＝0.9924)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员俩说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换。改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。