一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法与流程

本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法。

背景技术：

蝼蛄（Gryllotalpa），俗名耕狗、拉拉蛄、扒扒狗、土狗崽（西南地区）、蠹蚍（度比仔），可入药，用于治疗水肿、石淋、小便不利、瘰疬、臃肿恶疮等。

虫草属（Cordyceps）是指真菌寄生于昆虫，把虫体变成充满菌丝的僵虫，从僵虫前端生出有柄头状或棍棒状的子座，目前已经发现的虫草有400多种，多数都具有很高的药用及食用价值，它的生理功效主要有防动脉硬化、降血脂、保护心脑组织和增强免疫力、抗癌、抗菌、抗病等。

蝼蛄虫草（Gryllotalpa-Cordyceps）是在东北长白山地区发现的新物种，也称为朝鲜虫草，该虫草的虫体长约2厘米，草体5厘米左右，呈枯草黄。它是一种真菌与寄主昆虫（蝼蛄）的虫菌复合体，菌体寄生于蝼蛄体内，吸取其营养，虫身体内存满菌丝而死，菌丝从其头、腹部等部位长出，形似草，故称之为蝼蛄虫草。

虫草中主要含有的活性成分包括肌苷、腺苷等核苷类物质、虫草酸（D-甘露醇）和氨基酸等。核苷类物质能通过与嘌呤或嘧啶受体物质的结合参与到人体众多生理过程的调节中，而且，它作为形成核酸的前体物质，还能够帮助提高人体的免疫能力。现代许多研究均表明虫草素是虫草所特有的有效成分，且具有许多生物活性，氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，也是生物体内不可缺少的营养成分之一；基于这些特殊的生理活性，使得现有技术中对虫草的核苷类物质、虫草酸和氨基酸的提取、纯化、检测方法成为研究重点。

目前对两种虫草的研究较多，一种是冬虫夏草，另一种是蛹虫草。衡量虫草质量的重要指标是有效成分虫草酸和虫草核苷，目前这两种主要有效成分的测定方法很多，且都已比较成熟；但不同的虫草的成分及不同成分之间的含量也有较大的区别，所用到的检测方法也都有所不同。现有技术中并没有蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法。

本发明还提供一种蝼蛄虫草中核苷类物质的定量分析检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法，包括以下步骤：

（1）原料处理：将干净的蝼蛄虫草的虫体和草体分离，分别研磨成虫粉和草粉；

（2）样品储备液的制备：将虫粉和草粉溶解后，在30～70℃下超声提取1～4h，超声的频率为20～40Hz，离心取上清液获得样品储备液；

（3）虫草酸的含量测定：

（4）核苷的含量测定：利用HPLC进行测定，所述HPLC的条件为：0min，甲醇-水体积比为5：95；3min，甲醇-水体积比为10：90；8min，乙腈-水体积比为10：90；10min，甲醇-水体积比为5：95；

色谱柱：Apollo C18柱（250mm×4.6mm，5um）；

检测波长：260nm；

柱温：35℃；

流速：1mL/min；

进样量：10uL；

（5）氨基酸的含量测定。

优选地，步骤（2）还可具体分为虫粉和草粉的样品储备液的制备，若是虫粉，即将虫粉在50℃下，0～30Hz超声提取2h；若是草粉，即将草粉在60℃下30～40Hz超声提取3h。

本发明还提供一种蝼蛄虫草中核苷类物质的定量分析检测方法，是利用HPLC进行测定，所述HPLC的条件为：

流动相：0min，甲醇-水体积比为5：95；3min，甲醇-水体积比为10：90；8min，乙腈-水体积比为10：90；10min，甲醇-水体积比为5：95；

色谱柱：Apollo C18柱（250mm×4.6mm，5um）；

检测波长：260nm；

柱温：35℃；

流速：1mL/min；

进样量：10uL。

本发明针对蝼蛄虫草，将虫体与草体分别检测，利于了解虫体及草体各自的活性含量，并设置适宜的提取条件，减少长时间高频率超声对有效成分的损失，以提高蝼蛄虫草的应用价值最大化。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法，根据蝼蛄虫草的特性，从样品提取开始，分别优化出测定虫草酸、核苷和氨基酸的方法，最终获得了既快速准确，又节约成本测定条件，该方法的检测准确度高，样品添加回收率高，从而为蝼蛄虫草的检测建立了体系，填补了蝼蛄虫草活性成分检测的空白，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为D-甘露醇标准曲线。

图2到图5分别是腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷的标准曲线图。

图6为蝼蛄虫草-虫粉的腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷HPLC图。

图7为蝼蛄虫草-草粉的腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷HPLC图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

一、原料处理

将蝼蛄虫草用洁净软毛刷轻刷，除去表面泥沙，用剪刀将虫体和草体分离，分别称取虫体和草体0.6～0.7g，置于平面皿中，烘箱40℃，24h烘干称量干重。虫体和草体分开进行液氮研磨，将研磨好的粉末保存于封口带中，置于4℃冰箱保存，计算含水率，结果显示虫体和草体的含水量都不多，且二者差别不大（表1）。

表1 蝼蛄虫草含水率

二、样品储备液的制备

分别取蝼蛄虫草-虫粉，蝼蛄虫草-草粉供试品0.5g，置于50mL离心管中，用超纯水水溶，蝼蛄虫草-虫粉在50℃下0～30 Hz超声提取2h，草粉在60℃下30～40Hz超声提取3h。用超纯水补足失重，离心（4000r，5min)，取上清液于50mL离心管，再离心（4000r，5min)，取上清液于100mL容量瓶中定容，置于100mL棕色储液瓶，4℃冰箱保存，即为样品储备液。

实施例2 虫草酸含量测定

1、标准曲线制作

准确称取 0.15 g D-甘露醇标准品于50 mL棕色容量瓶中，以超纯水溶解并定容，摇匀。制成虫草酸标准溶液储备液（浓度为3000.0 μg/mL）。用超纯水将标准溶液储备液梯度稀释成浓度为 15、30、45 、60、75和 90 μg/mL的标准工作溶液，取标准工作溶液1 mL加入试管中，空白对照管加蒸馏水1 mL，然后每管加入0.015 mol/L高碘酸钾液1 mL，混匀，室温放置10min，每个试管加0.1%鼠李糖2 mL，充分混匀后，加入Nash试剂4 mL，53℃水浴保温15 min，即刻冷却，分光光度计413 nm处测光吸收，根据甘露醇标准品的光吸收计算样品中的甘露醇含量。

得出标准曲线的R²等于0.9976，试验数据与拟合函数之间的吻合程度较高。结果准确度高（图1，表2）。

2、方法验证

以已知含量北虫草为添加基质，按样品中D-甘露醇含量的80%、100%和 120%（以实际操作为准）三个水平进行添加回收试验。每个添加水平重复三次试验。

准确度系指测定的结果与真实值相符合的程度，可用来反映系统误差的大小，一般通过加样回收率实验来考察。通过回收率实验，可以检查分析过程中测试成分的损失情况，从而评价此分析方法的可靠性和准确度。在加样回收率实验中应该注意对照品的加入量，被测成分含有量与对照的加入量比值应该适当：过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分。同时应该保证次定量分析过程中，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系，即控制对照的加入量与供试品中被测成分的量之和必须在标准曲线线性范围之内。

由表3可知，D-甘露醇的添加回收率介于91.43～103.05%，该方法下的添加回收效果均较好，能够满足分析要求。

3、样品测定

取步骤二制备的储备液过0.45μm微孔滤膜，取0.03 mL，补水至1 mL，计算D-甘露醇含量，结果如表4，表4的结果是样品湿重情况下的D-甘露醇含量，其含量草粉中高于虫粉，但都处于高含量水平。

实施例3 核苷类化合物含量测定

1、标准品溶液制备

分别准确称取1 mg标准品（腺苷、肌苷、尿苷、鸟苷四种核苷）于棕色进样瓶中，加入1 mL甲醇，涡旋混匀，制成单标储备液。各取0.2 mL单标储液于1 mL棕色进样瓶，涡旋混匀，制成混标储备液，置于4℃冰箱保存。

2、HPLC条件的选择

文献报道腺苷、肌苷、尿苷、鸟苷四种核苷在250～260 nm的波长范围内吸收峰最显著。于是将标准混合液分别在200～400 nm的范围内以二极管阵列检测器进行扫描。最终吸收峰最显著波长为260 nm。

本文采用纯水提取方法，通过改变流动相中水和乙腈的比例随时间的变化规律，使 4 种标准物质的混合溶液达到分离。最终确定梯度洗脱程序。

通过反复试验，调整流动相梯度，优化色谱条件，最终得到了既快速准确，又节约成本的色谱条件（表5）。

HPLC条件：色谱柱：Apollo C18柱（250mm×4.6mm，5um）、检测波长：260nm、柱温：35℃、流速：1mL/min、进样量：10uL。

3、标准品线性方程

用单标确定保留时间；用超纯水将混标储备液梯度稀释成系列浓度的标准混合溶液（5、10、20、50、100μg/mL），待上样。每个浓度标准混合溶液连续进样 3 次，取平均值计算。

在上述HPLC条件下4种核苷类标准混合溶液的色谱图如图2到图5。

4、回收率实验

以蝼蛄虫草-虫粉和蝼蛄虫草-草粉样品为添加基质，按各样品中各核苷类物质含量的 50%、100%和150%三个水平进行添加回收试验。称样后添加上定量的标准品，涡旋混匀后室温放置8min，之后按上面的提取、检测方法进行含量测定。每个添加水平重复三次试验。

由表6得蝼蛄虫草-虫粉中肌苷、鸟苷、腺苷和尿苷的平均回收率在86.5～99.7%之间，RDS在1.0～6.4%之间。该方法下的回收率效果较好，能够满足分析要求。因此表明该方法的准确度可靠。

5、精密度试验

取蝼蛄虫草-虫粉提取液和蝼蛄虫草-草粉提取液连续进样 5 次，考察标准品和提取液中各目标物在出峰时间、峰面积上的差异性。

由表7可知，样品提取液在进行 HPLC 测定时，无论出峰时间还是峰面积的精密度都很好，虫粉和草粉中四种核苷的出峰时间的相对标准偏差（RSD）分别在0.05～0.14%之间和0.09～0.23%之间，峰面积的RSD在0.12～0.84%之间和0.11～0.93%之间，说明该方法下测定虫草中虫粉和草粉中核苷类物质的精密度都很好。

6、样品测定

取步骤二制备的样品储备液，将储备液分别稀释10倍、100倍。再将原储备液和稀释后储备液分别过0.45μm微孔滤膜，置于2mL进样瓶中，各做3个平行，上机分析。

通过计算得出蝼蛄虫草-虫粉含有尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷分别为2.862、0.431、2.117、0.1729 mg/g，草粉含有尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷分别为3.532、0.891、3.512、1.39 mg/g。结果显示的最终含量是样品湿重时含量。通过比较可以看出草粉中四种核苷的含量明显高出虫粉中四种核苷的含量。其中腺苷含量高出近10倍（表8）。从HPLC图谱可以看出，样品分离效果良好（图6和图7）。

实施例4 氨基酸测定

17种氨基酸测定：按照GB/T 5009.124-2003的方法进行测定。

通过分析得蝼蛄虫草-虫粉含粗蛋白为50.51%。蝼蛄虫草-草粉含粗蛋白为18.92%。都含有天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、缬、蛋、异亮、亮、苯丙、酪、赖、组、胱、半胱、精等17种氨基酸，其中以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸含量最高，同时均含有8种人体必须氨基酸。且虫粉中氨基酸各指标都明显高于草粉中含量。

通过以上对蝼蛄虫草虫体和草体中的虫草酸、四种核苷以及氨基酸的定量和定性的分析，可以得知蝼蛄虫草虫体和草体中均含大量的核苷，其中草体中的核苷含量要高于虫体。同时虫体和草体中还含有大量种类丰富的氨基酸，虫体中氨基酸含量要高于草体。虫草酸（D-甘露醇）的含量在虫体和草体也含量较高。因此蝼蛄虫草是具有很高的营养和药用价值。

通过计算得出蝼蛄虫草-虫体中虫草酸含量为10.96%，草体中虫草酸含量为12.75%。处于一个较高水平。