一种鲜冬虫夏草细胞活力的检测方法与流程

本发明涉及农产品检测领域，具体涉及一种快速、简便的检测鲜冬虫夏草细胞活力的方法。

技术背景

冬虫夏草是传统的名贵中药材，市场上多以其干品的形式存在。由于新鲜冬虫夏草保持原生态，很好的保持了细胞活力，也更好的保存了其营养物质和功效成分，特别是活性多肽和多糖等大分子。因此，近年催生了即食新鲜冬虫夏草的出现。冬虫夏草的新鲜程度与其鲜脆口感和营养、功效成分的保持有很大的关系。因此，如何判断鲜冬虫夏草的新鲜程度也成为了一个重要的课题。目前尚没有对鲜冬虫夏草的新鲜度进行检测的研究报道。

冬虫夏草的新鲜度可以通过其细胞活力检测来实现。四氮唑法(TTC法)广泛应用于种子活力和发芽率的测定，主要原理是应用生物体内活细胞进行呼吸作用时脱氢酶将呼吸链上的氢脱去，而四氮唑为一种无色氧化态物质，在接受氢后转变成红色三苯基甲臜(TTF)，有活性的冬虫夏草细胞会进行呼吸代谢，在呼吸代谢途径中脱下来的氢可以将无色的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)还原成红色的不溶于水的甲臜(TTF)，细胞活力越强，代谢活动也会越活跃，被染成的红色程度也就越深，死亡的细胞由于没有呼吸作用，因而不能被染色。因此通过观察鲜冬虫夏草切片的染色深浅以及染色均匀度可以判断鲜冬虫夏草的细胞活力，以便更好的进行鲜冬虫夏草的质量控制。

在以往报道的技术文献中，采用四氮唑法测定种子活力染色过程耗时一般都很长，一般需30小时以上，这很难满足快速检测的要求。如中国专利申请(公开号CN104686011A)一种测定茄子种子生活力的四氮唑染色法中，种子染色时间为15～40小时。TTC方法在中药材活力测定方面有较少的文献报道，也存在染色时间太长的问题。如文献《TTC-脱氢酶还原法测定滇重楼细胞活力优化条件筛选》对超低温保存的滇重楼用TTC法测定细胞活力的条件进行了优化，确定最佳条件是，采用pH值为7.0、浓度为0.8％的TTC溶液，在温度为22℃的条件下对实验材料染色21h。文献《人参细胞TTC-脱氢酶活力测定条件的优化》对人参细胞活力测定进行了研究，得出人参细胞活力测定的最佳条件为TTC溶液浓度0.4％、pH 7.5、反应温度25℃、反应时间18h。以上技术文献中提到的四氮唑法除了耗时太长外，直接应用于冬虫夏草细胞活力检测还存在重复性和稳定性差，敏感度低；又由于耗时太长，染色温度高于鲜冬虫夏草存储温度，这些方法不能准确真实地反映冬虫夏草细胞活力等问题。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的缺陷和不足，采取切片的方法，选择合适的切片厚度，加快了检测鲜冬虫夏草细胞活力时间；且在检测前进行前处理，使鲜冬虫夏草的活力得以保持，以使得检测结果的真实、可靠性；本发明在选择切片部位上也进行了研究，发现不同部位的灵敏度不同，选择冬虫夏草虫体第4-7对足区段能更快的反映细胞活力，缩短检测时间，增加灵敏度；现有技术中的类似检测方法的时间都非常长，而本发明提供的方法染色时间选择1～2小时就能反映出细胞活力，提供一种快速、便捷、准确检测鲜冬虫夏草细胞活力来反映冬虫夏草新鲜程度的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

(1)将鲜冬虫夏草从储存环境中取出，进行前处理；

(2)将经过前处理的鲜冬虫夏草进行切片，切片厚度为1～2mm；

(3)将鲜冬虫夏草切片放置于装有质量分数0.3％～0.5％的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液的小烧杯中浸透，置于37℃避光染色；

(4)根据染色的深浅以及染色的均匀度判断鲜冬虫夏草细胞活力的高低，颜色越红，染色越均匀，表明鲜冬虫夏草细胞活力越强。

优选地，步骤(1)所述的前处理方法为：将鲜冬虫夏草浸没在37℃的5％葡萄糖溶液15min。

优选地，步骤(2)中的切片为冬虫夏草虫体第4-7对足区段切片。

优选地，步骤(3)中2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色溶液质量分数为0.3％。

优选地，步骤(3)中染色时间为1～2h。

优选地，步骤(3)中所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液用pH 7.5的磷酸缓冲液配制而成。

本发明所具有的优点和积极效果在于：

(1)本发明采取的切片染色方式，选择了合适的切片厚度，使染色时间大大缩短，提高了检测的效率。

(2)本发明对鲜冬虫夏草进行了前处理，较好的保存了鲜冬虫夏草细胞活力，能够真实的反映储存环境中样品的新鲜程度。

(3)本发明在大量实验过程中，通过分析发现，同一根鲜冬虫夏草的不同部位染色有较大的差异，选取了冬虫夏草虫体，且为虫体第4-7对足区段进行切片，染色，大大的提高了测定方法的灵敏度、准确性、稳定性和重现性。

(4)本发明方法操作简单，成本低廉，无需仪器检测，能够快速直观的对样品新鲜程度进行判断，适用于大规模推广使用。

附图说明

图1是鲜冬虫夏草整体图，冬虫夏草虫体具有8对足，胸足3对，靠近头部，腹足4对，尾足1对，其中A是子座区段，B是虫体头部至第4对足区段，C是虫体第4-7对足区段，D是虫体第7对足至尾部区段。

图2是不同染色时间的鲜冬虫夏草细胞活力测定结果，其中图中A是染色0.5小时后的切片，B是染色1小时后的切片，C是染色2小时后的切片，D是染色4小时后的切片，E是染色8小时后的切片。

图3是不同处理方法对鲜冬虫夏草细胞活力测定结果，其中图A是经过前处理的冬虫夏草染色切片，B是未经过前处理的冬虫夏草染色切片。

图4是不同部位的鲜冬虫夏草细胞活力测定结果，其中图A是子座染色切片，B是虫体头部至第4对足区段染色切片，C是虫体第4-7对足区段染色切片，D是虫体第7对足至尾部区段染色切片。

图5是不同浓度的TTC溶液染色后的鲜冬虫夏草细胞活力测定结果，其中图A是经0.1％TTC溶液染色的切片，B是经0.2％TTC溶液染色的切片，C是经0.3％TTC溶液染色的切片，D是经0.4％TTC溶液染色的切片，E是经0.5％TTC溶液染色的切片。

图6是不同储藏时间的鲜冬虫夏草细胞活力测定结果，其中图A是储存1个月后的染色切片，B是储存2个月后的染色切片，C是储存3个月后的染色切片，D是储存4个月后的染色切片，E是储存5个月后的染色切片，F是储存6个月后的染色切片。

具体实施例

本发明实施例是用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

实施例1

(1)将鲜冬虫夏草从储存环境中取出，进行前处理，方法为：放置于预热到37℃的5％葡萄糖溶液浸没，37℃水浴15min；

(2)将步骤(1)处理的鲜冬虫夏草虫体部分进行切片，且切片部位为虫体第4-7对足区段，切至1～2mm薄片，切10片；

(3)将鲜冬虫夏草切片放置于装有0.3％的TTC溶液的小烧杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)在染色时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时时分别取出2片染色后的鲜冬虫夏草切片，吸干表面水分，观察颜色，拍照。

结果如图2所示，由结果可以看出，经过五个不同时间的染色，染色0.5小时后，虫草切片开始着色，但是颜色不均匀，呈淡红色；染色1小时后的切片着色均匀且颜色很深，呈深红色；染色2小时后颜色也呈现深红色；染色4小时后切片的红色有所变淡，经过8小时染色后，染色的切片颜色呈淡红色，甚至有白色斑点。以上结果表明，长时间的染色会褪色，最佳染色时间是1～2小时。

实施例2

(1)将鲜冬虫夏草从储存环境中取出2根，一根进行前处理，方法为：放置于预热到37℃的5％葡萄糖溶液浸没，37℃水浴15min；另外一根不做前处理，直接待用；

(2)分别将步骤(1)处理的鲜冬虫夏草和不做前处理的冬虫夏草虫体相同部位进行切片，且切片部位为虫体第4-7对足区段，切至1～2mm薄片，每根分别切4片；

(3)将2根鲜冬虫夏草切片分别放置于装有质量分数为0.3％的TTC溶液的小烧杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)在染色时间为2小时时分别取出2根鲜冬虫夏草的切片，吸干表面水分，观察颜色，拍照。

结果如图3所示，由结果可以看出，经过前处理的鲜冬虫夏草切片颜色呈深红色，切片断面都全部染色，未经过前处理的鲜冬虫夏草切片断面红色相对较浅，且断面染色不完全，有白色斑点。以上结果表明，经过前处理能够较好的保持从储存环境取出的鲜冬虫夏草细胞活力，从而更加真实准确的反映鲜冬虫夏草样品细胞活力和新鲜度。

实施例3

(1)将鲜冬虫夏草从储存环境中取出，进行前处理，方法为：放置于预热到37℃的5％葡萄糖溶液浸没，37℃水浴15min；

(2)将步骤(1)处理的鲜冬虫夏草分为4个区段进行切片，分别为冬虫夏草子座区段、虫体头部至第4对足区段、第4-7对足区段和第7对足至尾部，4个区段中每个区段取4片，每片切成1～2mm薄片；

(3)将4个不同区段的鲜冬虫夏草切片分别放置于装有质量分数为0.3％的TTC溶液的小烧杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)染色2小时后取出鲜冬虫夏草切片，吸干表面水分，观察颜色，拍照。

结果如图4所示，由结果可以看出，子座区段只有边缘呈浅红色，中心部位未能染色，虫体头部至第4对足区段染色很浅，中心有白斑未染色，虫体第4-7对足区段染色最深，断面全部染色呈深红色，第7对足至尾部区段染色较浅，也有少量白斑未染色。以上结果表明，虫体第4-7对足区段能够最好的体现鲜冬虫夏草细胞活力，提高检测的灵敏度，从而更加真实准确的反映鲜冬虫夏草样品细胞活力和新鲜度。

实施例4

(1)将鲜冬虫夏草从储存环境中取出一根进行前处理，方法为：放置于预热到37℃的5％葡萄糖溶液浸没，37℃水浴15min；

(2)将步骤(1)处理的鲜冬虫夏草进行切片，且切片部位为虫体第4-7对足区段，切至1～2mm薄片，切10片；

(3)将10片鲜冬虫夏草切片分成5组，分别放入五个装有适量质量分数为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％TTC溶液的小烧杯中浸透，并置于37℃水浴中避光染色2小时；

(4)在染色时间为2小时后取出鲜冬虫夏草的切片，吸干表面水分，观察颜色，拍照。

结果如图5所示，由结果可以看出，经质量分数为0.1％和0.2％的TTC溶液染色的切片断面红色相对较浅，且断面染色不完全，有少量白色斑点，而经质量分数为0.3％、0.4％和0.5％的TTC溶液染色的切片颜色均匀，且呈深红色，以质量分数为0.3％的TTC浓度更好。以上结果表明，使用质量分数为0.3％-0.5％的TTC溶液能够较好的检测从储存环境取出的鲜冬虫夏草细胞活力，从而更加真实准确的反映鲜冬虫夏草样品细胞活力和新鲜度。

实施例5

(1)取经过不同储藏时间的鲜冬虫夏草6根(储存时间分别为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月)，进行前处理，方法为：放置于预热到37℃的5％葡萄糖溶液浸没，37℃水浴15min；

(2)将步骤(1)处理的6根不同储存时间的鲜冬虫夏草进行切片，且切片部位为距离虫体第4-7对足区段，切至1～2mm薄片，每根鲜冬虫夏草分别切4片；

(3)将6根鲜冬虫夏草切片分别放置于装有质量分数为0.3％的TTC溶液的小烧杯中浸透，置于37℃水浴中避光染色；

(4)在染色时间为2小时后取出鲜冬虫夏草的切片，吸干表面水分，观察颜色，拍照。

结果如图6所示，由结果可以看出，6根不同储存时间的鲜冬虫夏草染色有显著的差异，其中储存1个月的鲜冬虫夏草染色呈深红色，且断面染色均匀，没有白色斑点；储存2个月的鲜冬虫夏草染色呈深红色，但断面有少量白色斑点，斑点面积很小；储存3个月的鲜冬虫夏草染色呈浅红色，断面有少量白色斑点略多；储存4个月的鲜冬虫夏草染色呈浅红色，断面白色斑块，面积较大；储存5个月的鲜冬虫夏草仅外缘小面积呈浅红色，中心部位基本未染色；储存6个月的鲜冬虫夏草全部未染色，断面呈白色。以上结果表明，本发明方法能够快速、简便的检测鲜冬虫夏草的细胞活力，判断鲜冬虫夏草的大致储存时间。