一种硫酸鱼精蛋白副凝固实验检测方法与流程

本发明涉及一种硫酸鱼精蛋白副凝固实验检测方法。

背景技术：

弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation；DIC)不是一种独立的疾病，而是许多疾病在进展过程中产生凝血功能障碍的最终共同途径，是一种临床病理综合征。由于血液内凝血机制被弥散性激活，促发小血管内广泛纤维蛋白沉着，导致组织和器官损伤；另一方面，由于凝血因子的消耗引起全身性出血倾向。两种矛盾的表现在DIC疾病发展过程中同时存在，并构成特有临床表现。在DIC已被启动的患者中引起多器官功能障碍综合征将是死亡的主要原因。国内尚无发病率的报道。DIC病死率高达31％～80％。因此，准确检测弥散性血管内凝血显得尤为重要。

1999年10第七届全国血栓与止血学术会上提出的1999年10第七届全国血栓与止血学术会上，提出了经典的血浆蛋白副凝固实验用于诊断弥散性血管内凝血(DIC)，但是由于其纯手工操作，肉眼判断结果，导致准确度不高，临床的认可度不是太高，目前有被更为灵敏和特异的D-二聚体和纤维蛋白降解产物(FDP)取代的趋势。而D-二聚体和纤维蛋白降解产物检测的成本太高。DIC的发生首先是纤维蛋白单体(FM)的出现，而目前测定纤维蛋白单体(FM)的试剂相当昂贵，而且需要特殊仪器。

急需提供一种成本低廉、检测结果准确的检测方法能测定或反应FM的存在。或者能找到D-D、FDP的替代方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种成本低廉、灵敏度和特异性高的检测方法，具体是血浆蛋白副凝固实验的改良方法。

本发明一种硫酸鱼精蛋白副凝固实验检测方法，步骤如下：取待检血浆，加入浓度为0.005g/ml的硫酸鱼精蛋白溶液，测定反应体系的散射光强度变化。

反应体系中，若有纤维蛋白凝块的形成，样品的散射光强度逐渐增强，仪器把这种光学变化描绘成凝固曲线，当样品完全凝固以后，散射光的强度得以稳定，同时记录凝固时间(T)和曲线上升高度(dH)。

优选地，仪器自动加样，和/或先将待检血浆预热到37℃。

优选地，所述硫酸鱼精蛋白溶液的加入量为血浆的1/4。

其中，测定反应体系的散射光强度变化采用全自动凝血分析仪如，型号为SYSMEX CA7000的全自动凝血分析仪检测。

本发明方法可以准确、有效地检测弥散性血管内凝血，而且成本非常低廉，适用于临床使用，应用前景非常良好。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1阴性实验结果图；

图2阳性实验结果图；

图3试剂名称及位置设置图；

图4本发明方法的ROC曲线图；

图5现有方法的ROC曲线图；

图6本发明方法与FM检测的ROC曲线图；

图7重复性实验结果(阴性样本)；

图8重复性实验结果(阳性样本)。

具体实施方式

实施例1 本发明硫酸鱼精蛋白副凝固实验检测方法

1、检测仪器和试剂

光学法凝血测定仪，SYSMEX公司CA7000。

硫酸鱼精蛋白试剂，北京悦康凯悦制药有限公司生产的硫酸鱼精蛋白注射液(5ml：50mg)，其中硫酸鱼精蛋白的浓度为0.01g/ml。

2、检测方法

反应管中加入血浆120uL，37℃预温3分钟，加入硫酸鱼精蛋白溶液与生理盐水的混合溶液30uL(硫酸鱼精蛋白注射液：生理盐水的体积比1：1)，加入试剂后检测反应体系的散射光强度变化。

判定标准：在600s内，散射光强度的反应曲线没有变化，判定为阴性(如图1所示)；反之，600s内散射光强度的反应曲线升高则判定为阳性(如图2所示)。

以下用是实验例的方式来说明本发明的有益效果：

实验例1 本发明方法的灵敏度和特异性

1、实验方法

采用光学法凝血测定仪，SYSMEX公司CA7000，根据图3设置检测方案(试剂量，样本量，加样时间，反应检测时间等)，试剂名称及位置后，采用实施例1的方法，进行灵敏度和特异性的检测。

2、实验结果

以曲线上升高度(图中H1.25)、血浆凝固时间(图中T1.25)及其比值(比值1.25)与金标准制作ROC曲线；ROC曲线图如图4所示，可以看出，曲线上升高度(dH)与金标准正相关，反应凝固时间(T)与金标准负相关。本发明方法曲线上升高度(dH)的CUT OFF值为5.5，其灵敏度为82.0％，特异性为92.7％，同时曲线下面积为0.913。

实验结果说明，本发明方法的灵敏度高，特异性强，曲线下面积大，可以准确检测。

实验例2 本发明方法与现有硫酸鱼精蛋白副凝固实验检测方法的比较

现有文献报道的改良的硫酸鱼精蛋白副凝固实验，其中每120uL血浆，使用36uL硫酸鱼精蛋白溶液，其ROC曲线如图5所示，其曲线下面积为0.857。

可以看出，本发明检测方法的曲线下面积显著高于现有硫酸鱼精蛋白副凝固实验检测方法的曲线下面积，说明本发明方法的检测准确度显著更高。

实验例3 本发明方法与现有临床方法的临床检测比较

本发明方法与DIC经典指标D-二聚体、FDP的比较：

1、实验方法

本发明方法：实施例1的方法。

D-二聚体、FDP的方法：分别采用SYSMEX公司CS5100的D-二聚体检测试剂和SYSMEX公司CS5100的FDP试剂，按照说明书上的操作步骤操作。以D-二聚体和FDP同时大于参考值为阳性金标准，二者同时为阴性为健康对照人群。

一共检测住院病人392例。

2、检测结果

D-二聚体和FDP同时大于参考值人数233例，本发明方法检出阳性202例，检出率为金标准方法的92.2％；

D-二聚体和FDP同时为阴性为健康对照人群80例，本发明方法检出阴性63例。

还有79例为D-二聚体阳性，FDP阴性患者，这部分人群中，新型3P检测出阳性患者38例(阳性比率38/79＝48％)。

实验结果说明，本发明方法与目前金标准检测方法的结果高度一致，能够作为DIC的首选筛查方法，更是DD和FDP检测的有效补充。

费用对比：采用D-二聚体、FDP的方法检测，每人约花费检测成本40元，而采用本发明方法，则花费检测成本不到0.6元，对比可以看出，本发明方法的成本是现有方法的1.5％，用于临床普遍筛查，阳性或可疑阳性患者再进一步做DD和FDP定量检测,可以大大提高患者的诊断正确率，避过度检查。

实验例4 本发明方法与现有FM测定方法的比较

本发明方法与FM定量检测的比较：

1、实验方法

本发明方法：实施例1的方法。

FM定量的方法：采用STAGO公司STA-R Evolution全自动血凝仪及STAGO公司的纤维蛋白单体(FM)检测试剂盒，按照说明书上的操作步骤操作。以定量测定的纤维蛋白单体(FM)大于参考值为阳性金标准，小于等于参考值为健康对照人群。

一共测定住院病人50例。

以曲线上升高度(图中H1.25)、血浆凝固时间(图中T1.25)与金标准制作ROC曲线。

2、检测结果

ROC曲线图如图6所示，可以看出，曲线上升高度(dH)与FM正相关，反应凝固时间(T)与FM负相关。本发明方法曲线上升高度(dH)CUT OFF值为5.5；其灵敏度为81.0％，特异性为71.4％，同时曲线下面积为0.833。

实验结果说明，本发明方法可以准确检测纤维蛋白单体(FM)，说明其用于检测弥散性血管内凝血的准确度高。

实验例5 本发明方法的批内精密度

1、实验方法

分别使用1份阴性标本和1份阳性标本，按照实施例1的方法检测，每个标本一次性检测20次。

2、实验结果

结果如图7和图8所示，本发明方法的相对标准差(RSD)小于5.0％，说明批内批内精密度好。

综上，本发明方法可以有效准确、有效地检测弥散性血管内凝血，而且成本非常低廉，适用于临床批量筛查，应用前景非常良好。