一种用分子印迹试纸条快速检测三聚氰胺的方法与流程

本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种用分子印迹试纸条快速检测三聚氰胺的方法。

背景技术：

三聚氰胺（MEL）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，简称三胺，分子量为126.13。是一种无色单斜棱晶体，无味，在水中和有机溶剂中的溶解度都很低。三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工产品，作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料是其最主要的用途，含三聚氰胺的化学化工产品具有不易燃，耐水、耐热、耐电弧、耐老化、耐化学腐蚀的优点。

三聚氰胺及其衍生物本身并不是蛋白质，对人体健康不仅不能提供营养反而对身体健康造成负面影响。但因其含氮量较高，达到66%，常被非法加入牛奶、饼干等日常食物中，如2008年9月，我国爆发的婴幼儿奶粉中非法添加三聚氰胺污染事件。

牛奶中添加三聚氰胺之后，只能在检测中造成蛋白质含量增高的假象，长期重复大量摄入三聚氰胺可能导致膀胱结石、肾结石等。食品与药品监管局（FDA）设定三聚氰胺的每人每日耐受摄入量（TDI）为0.63 mg/kg体重。对婴幼儿奶粉中三聚氰胺的安全阂值要求更为严格，设定每日耐受摄入量为成年人的十分之一，体重以7.0 kg计算，则婴幼儿配方奶粉中的安全值为0.0441 mg。因此，牛奶中三聚氰胺的检测具有重要的意义。而传统评价牛奶质量的凯氏定氮法只能测定氮的总量，但并不能有效区分氮的来源和种类。常规的痕量三聚氰胺分析方法主要包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用检测法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱法 （HPLC-MS）、酶联免疫吸附法（ELISA），这些方法或多或少都存在仪器操作较为复杂、繁琐、时间较长等缺点，难以满足野外或大批量现场快速筛选检测的要求。在三聚氰胺检测方法中，迫切需要一种具有更高灵敏度和检出限的快速检测方法，而分子印迹技术具有的高选择性和高灵敏度的特点，如能与快速检测试纸结合从而建立对三聚氰胺更为简便快捷且灵敏度符合日常分析要求的方法是具有非常良好的前景及实际应用意义的。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的三聚氰胺的检测方法存在前处理复杂、时间长、成本高等现状，提供一种三聚氰胺的快速检测方法，该方法简单、快速、成本低。本发明可用于牛奶样品中三聚氰胺的快速分析检测。

具体步骤为：

(1) 三聚氰胺分子印迹聚合物的制备

称取0.0020 ~ 0.0032 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加入20 mL 浓度为3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和2 ~ 7mL 分析纯α-甲基丙烯酸，超声10分钟，静置过夜后，加入0.01 ~ 0.03g过硫酸铵引发，反应2 ~ 7分钟，即制得三聚氰胺分子印迹聚合物（MIP），在冰箱中储存，备用。

(2) 高碘酸氧化法制备葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺(GOD-MEL)

称取4 ~ 6 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL浓度为0.1 mol/L的NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋（MW4000）中，对1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC缓冲液透析，4 ℃过夜，加入20 mL浓度为0.2 mol/L pH = 9.5碳酸盐缓冲液，使GOD的pH升高至9.0 ~ 9.5；取另一个10 mL比色管，加入8 ~ 12 mg三聚氰胺和1 mL浓度为0.01 mol/L、pH = 9.5的碳酸盐缓冲液，与上述GOD混合，室温避光搅拌2小时；往混合液中加入0.1 mL浓度为4 mg/mL 的NaBH₄混匀，4 ℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，对浓度为0.15 mol/L 、pH = 7.4的PBS缓冲液透析，4 ℃过夜；透析完成后，将标记物分装入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

(3) 试纸条的制作

剪取4 × 1 cm（长×宽）的塑料基底，在黑色基底区域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴区域，将硝酸纤维素膜（NC膜）贴在该孔穴区域背面，将步骤（1）制得的三聚氰胺分子印迹聚合物滴加在NC膜表面，分布均匀后室温条件下晾干，接着，往MIP上滴加15 ~ 25 mL质量百分比浓度为25%的乙醇，洗脱2 ~ 4分钟，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印迹聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，从而制备得到保留有特异性识别孔穴的三聚氰胺分子印迹试纸条，避光保存。

(4) 检测方法

取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条一支，将15 ~ 25 μL标记好的GOD-MEL溶液滴加到已经除去模板分子的分子印迹试纸条上，孵化反应5分钟，用二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的杂质，竞争过程是在不同浓度MEL的样品中进行的，滴加15 ~25μL待测样品溶液至孵化后的试纸条上，反应3分钟，用二次水冲洗；将竞争后的试纸条滴加15 ~ 25 μL的染料底液（包含浓度为3×10^-4 mol/L的荧光桃红、浓度为0.02 g/mL的葡萄糖、浓度为0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液），进行显色反应。调节荧光光度计的最大激发波长为515 nm、激发光(EX)狭缝宽度为1.5 nm、发射光(EM)狭缝宽度为3.0 nm，将显色反应后的试纸条置于荧光光度计中进行荧光强度检测，实现定量分析。另外，对于大批量样品的在线监测可借助半定量分析完成，即用肉眼对颜色进行简单判断（目视比色法）或者用紫外灯进行拍照对比。

(5) 工作曲线的绘制

取步骤（3）制备好的三聚氰胺分子印迹试纸条，按步骤（4）对不同浓度的三聚氰胺标准溶液进行荧光检测，记录荧光强度，绘制工作曲线。通过对工作曲线的对数回归分析可知，试纸条的荧光强度差与1×10^-8 mol/L ~ 1×10^-4 mol/L三聚氰胺浓度的对数呈线性关系，线性回归方程为ΔI_F = 61.19lgC + 572.83，线性相关系数达到0.9944。

(6) 牛奶样品中三聚氰胺含量的测定

移取300 ~ 600 μL市售牛奶样品，用0.1 mol/L pH = 5的醋酸醋酸钠缓冲溶液定容至10 mL，作为待测样品。取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条一支，将20 μL标记好的GOD-MEL溶液滴加到已经除去模板分子的分子印迹试纸条上，孵化反应5分钟，用二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的杂质。滴加20 μL待测样品溶液至孵化后的试纸条上，反应3分钟，用二次水冲洗即可。将竞争后的试纸条滴加20 μL的染料底液（包含浓度为3×10^-4 mol/L的荧光桃红、浓度为0.02 g/mL的葡萄糖、浓度为0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液），进行显色反应。将显色反应后的试纸条置于荧光光度计中进行荧光强度检测，根据工作曲线计算样品中三聚氰胺的浓度。

本发明利用化学法聚合得到三聚氰胺的分子印迹聚合物，制备成对三聚氰胺具有特异性识别能力的分子印迹试纸条，试纸条反应区表面的孔穴能够同时识别三聚氰胺及具有相同结构的葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺。将洗脱模板分子的试纸条在高浓度的葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺中孵化后，印迹孔穴被葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺占据。随后竞争反应是在样品中的三聚氰胺和印迹膜上的葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺之间进行，三聚氰胺能够竞争取代葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺而重新占据孔穴。随着样品中三聚氰胺分子浓度的增加，印迹膜上被竞争取代的葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺就越多，即残留在印迹膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印迹膜表面的葡萄糖氧化酶能够与底液中的葡萄糖发生酶解反应产生过氧化氢，过氧化氢进一步氧化分解底液中的荧光桃红使其褪色，因此，通过荧光分光光度计检测试纸条的荧光强度，实现样品中三聚氰胺的快速定性、定量或半定量分析检测。

本发明的有益效果是：

1. 本发明利用分子印迹试纸条及荧光分光光度法来检测三聚氰胺，克服了现有的三聚氰胺检测方法前处理复杂、时间长、成本高等现状，该方法具有简单、快速、成本低、准确可靠等优点，可用于牛奶制品中三聚氰胺的在线痕量检测，实现对奶制品的食品安全生产监管的目的。

2. 本发明待检样品溶液避免了复杂样品的前处理过程。

3. 本发明检测方法灵敏度高，在1.0×10^-9 mol/L ~ 1.0×10^-4 mol/L浓度范围内，荧光强度差与标准溶液浓度的负对数呈良好的线性关系，检测方法的有效回收率为91.2 % ~ 112.05 %，最低检出限为9.0 × 10^-10 mol/L（3δ_b/K，δ_b为11次空白样品检测的标准偏差；K为工作曲线的斜率）。

附图说明

图1为本发明工作曲线标准荧光比色卡。

图中：工作曲线紫外照片从左往右依次为空白组、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-4mol/L。

图2为本发明三聚氰胺标准溶液含量与荧光显色强度的关系图。

图中：三聚氰胺浓度a ~ g分别为：1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-9mol/L、空白组。

图3为本发明三聚氰胺浓度的校准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步描述，但不限制本发明的使用范围和应用范围。

实施例1：

（1）三聚氰胺分子印迹聚合物的制备

称取0.0020 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加入20 mL 浓度为3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和2mL α-甲基丙烯酸，超声10分钟，静置过夜后，加入0.013g过硫酸铵引发，反应2分钟，即制得三聚氰胺分子印迹聚合物（MIP），在冰箱中储存，备用。

（2）高碘酸氧化法制备葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺(GOD-MEL)

称取4 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL浓度为0.1 mol/L的 NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋（MW4000）中，对1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC缓冲液透析，4 ℃过夜，加入20 mL 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸盐缓冲液，使GOD的pH升高至9.0；取另一个10 mL比色管，加入8 mg三聚氰胺和1 mL 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸盐缓冲液，与上述GOD混合，室温避光搅拌2小时；往混合液中加入0.1 mL浓度为4 mg/mL的NaBH₄混匀，4 ℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，对0.15 mol/L pH = 7.4的PBS缓冲液透析，4 ℃过夜；透析完成后，将标记物分装入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

（3）试纸条的制作

剪取4 × 1 cm（长×宽）的塑料基底，在黑色基底区域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴区域，将硝酸纤维素膜（NC膜）贴在该孔穴区域背面，将步骤（1）制得的三聚氰胺分子印迹聚合物滴加在NC膜表面，分布均匀后室温条件下晾干，接着，往MIP上滴加15 mL质量百分比浓度为25%的乙醇，洗脱2分钟，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印迹聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，从而制备得到保留有特异性识别孔穴的三聚氰胺分子印迹试纸条，避光保存。

（4）待测样品溶液的制备：精密移取1.0 mL待检牛奶样品于10 mL具塞比色管中，用0.1 mol/L pH = 5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，作为样品组；平行移取1.0 mL同批次牛奶样品至10 mL具塞比色管中，加入0.5 mL 1.0×10^-4 mol/L三聚氰胺标准溶液，用0.1 mol/L pH = 5的醋酸钠缓冲溶液定容作为加标组，每组平行测定三次。

（5）取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条，在其反应区内滴加20 μL GOD-MEL，孵化反应5分钟，用10 mL二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的杂质。

（6）将20 μL步骤（4）样品组的待测样品滴加到步骤（5）孵化后的试纸条上，反应3分钟，用二次水冲洗。

（7）将竞争后的试纸条滴加20 μL的染料底液（包含浓度为3 × 10^-4mol/L荧光桃红、浓度为0.02g/mL葡萄糖、浓度为0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液），进行显色反应3分钟。

（8）取荧光比色皿，将显色反应后的试纸条置于RF5301荧光光度计中进行荧光强度检测，该体系采用最大激发波长为515 nm，EX和EM的狭缝宽度分别为1.5 nm、3.0 nm，进行荧光强度检测，且半定量分析时可用肉眼对颜色进行简单判断以及用紫外灯进行拍照，与荧光标准比色卡进行比对。

（9）加标样品组测定方法同上，采集荧光数据进行加标回收率实验。

实施例2：

（1）三聚氰胺分子印迹聚合物的制备

称取0.003 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加入20 mL 浓度为3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和5mL α-甲基丙烯酸，超声10分钟，静置过夜后，加入0.02g过硫酸铵引发，反应5分钟，即制得三聚氰胺分子印迹聚合物（MIP），在冰箱中储存，备用。

（2）高碘酸氧化法制备葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺(GOD-MEL)

称取5 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL浓度为0.1 mol/L的 NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋（MW4000）中，对1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC缓冲液透析，4 ℃过夜，加入20 mL 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸盐缓冲液，使GOD的pH升高至9.5；取另一个10 mL比色管，加入10 mg三聚氰胺和1 mL 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸盐缓冲液，与上述GOD混合，室温避光搅拌2小时；往混合液中加入0.1 mL浓度为4 mg/mL的NaBH₄混匀，4 ℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，对0.15 mol/L pH = 7.4的PBS缓冲液透析，4 ℃过夜；透析完成后，将标记物分装入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

（3）试纸条的制作

剪取4 × 1 cm（长×宽）的塑料基底，在黑色基底区域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴区域，将硝酸纤维素膜（NC膜）贴在该孔穴区域背面，将步骤（1）制得的三聚氰胺分子印迹聚合物滴加在NC膜表面，分布均匀后室温条件下晾干，接着，往MIP上滴加20 mL质量百分比浓度为25%的乙醇，洗脱3分钟，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印迹聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，从而制备得到保留有特异性识别孔穴的三聚氰胺分子印迹试纸条，避光保存。

（4）准确移取1.0 mL待检牛奶样品于10 mL具塞比色管中，用0.1 mol/L pH=5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，作为样品组。平行移取1.0 mL同批次牛奶样品至10 mL具塞比色管中，加入1.0 mL 1.0×10^-6 mol/L三聚氰胺标准溶液，用0.1 mol/L pH=5的醋酸钠缓冲溶液定容作为加标组，每组平行测定三次。

（5）取步骤（3）制备的三聚氰胺分子印迹试纸条，在其反应区内滴加20 μL GOD-MEL，孵化反应5分钟，用10 mL二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的杂质。

（6）将20 μL步骤（4）样品组的待测样品滴加到步骤（5）孵化后的试纸条上，反应3分钟，用二次水冲洗。

（7）将竞争后的试纸条滴加20 μL的染料底液（包含3 × 10^-4 mol/L荧光桃红、0.02 g/mL葡萄糖、0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液），进行显色反应3分钟。

（8）取荧光比色皿，将显色反应后的试纸条置于RF5301荧光光度计中检测其荧光强度，设置最大激发波长为515 nm，EX和EM的狭缝宽度分别为1.5 nm、3.0 nm进行荧光强度检测。另外，对于半定量分析，可用肉眼对颜色进行简单判断以及用紫外灯进行拍照，与荧光标准比色卡进行比对即可完成。

（9）加标样品组测定方法同上，采集荧光数据进行加标回收率实验。

实施例3：

（1）三聚氰胺分子印迹聚合物的制备

称取0.0032 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加入20 mL 浓度为3×10^-4 mol/L的三聚氰胺（MEL）溶液和7mL α-甲基丙烯酸，超声10分钟，静置过夜后，加入0.03g过硫酸铵引发，反应7分钟，即制得三聚氰胺分子印迹聚合物（MIP），在冰箱中储存，备用。

（2）高碘酸氧化法制备葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺(GOD-MEL)

称取6 mg葡萄糖氧化酶（GOD）溶于1 mL二次水，加入0.2 mL浓度为0.1 mol/L的 NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋（MW4000）中，对1 mmol/L pH = 4.4的HAC-NaAC缓冲液透析，4 ℃过夜，加入20 mL 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸盐缓冲液，使GOD的pH升高至9.5；取另一个10 mL比色管，加入12 mg三聚氰胺和1 mL 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸盐缓冲液，与上述GOD混合，室温避光搅拌2小时；往混合液中加入0.1 mL浓度为4 mg/mL 的NaBH₄混匀，4 ℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，对0.15 mol/L pH = 7.4的PBS缓冲液透析，4 ℃过夜；透析完成后，将标记物分装入1 mL比色管中，4 ℃避光保存。

（3）试纸条的制作

剪取4 × 1 cm（长×宽）的塑料基底，在黑色基底区域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴区域，将硝酸纤维素膜（NC膜）贴在该孔穴区域背面，将步骤（1）制得的三聚氰胺分子印迹聚合物滴加在NC膜表面，分布均匀后室温条件下晾干，接着，往MIP上滴加25 mL质量百分比浓度为25%的乙醇，洗脱4分钟，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印迹聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，从而制备得到保留有特异性识别孔穴的三聚氰胺分子印迹试纸条，避光保存。

（4）待测样品溶液的制备：精密移取1.0 mL待检牛奶样品于10 mL具塞比色管中，用0.1mol/L pH=5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，作为样品组。平行移取1.0 mL同批次牛奶样品至10 mL具塞比色管中，加入0.4 mL 1.0×10^-6 mol/L三聚氰胺标准溶液，用0.1 mol/L pH=5的醋酸钠缓冲溶液定容作为加标组，每组平行测定三次。

（5）取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条，在其反应区内滴加20 μL葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺溶液，孵化反应5分钟，用10 mL二次水淋洗，洗掉未孵化上去的GOD-MEL和其他的杂质。

（6）将20 μL步骤（4）样品组的待测样品滴加到步骤（5）孵化后的试纸条上，反应3分钟，用二次水冲洗。

（7）将竞争后的试纸条滴加20 μL的染料底液（包含3 × 10^-4 mol/L荧光桃红、0.02g/mL葡萄糖、0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液），进行显色反应3分钟。

（8）取荧光比色皿，将显色反应后的试纸条置于RF5301荧光光度计中进行荧光强度检测，该体系采用最大激发波长为515 nm，EX和EM的狭缝宽度分别为1.5 nm、3.0 nm进行荧光强度检测，且半定量分析时可用肉眼对颜色进行简单判断以及用紫外灯进行拍照，与荧光标准比色卡进行比对。

（9）加标样品组测定方法同上，采集荧光数据进行加标回收率实验。

根据上述检测方法及计算公式，三批牛奶样品中未检出添加三聚氰胺，加标回收率在91.2％ ~ 112.05％范围内，相对标准偏差为2.3％ ~ 2.7％。三聚氰胺的测定方法回收率与相对标准偏差见表1。