金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其使用方法。

背景技术：

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，是引起化脓性感染最常见的病原菌，包括局部化脓性感染、系统性感染和全身性感染。因此，建立快速、方便、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法，对于人体健康有着重要意义。

金黄色葡萄球菌的现有检测方法中，最为成熟的是基于细菌培养模式的传统方法，应用最广泛的方法是基于细菌核酸的PCR法。基于细菌培养模式的传统方法虽然可靠性好、灵敏度高，却耗时费力，通常需要数天的时间才能得到检测结果，同时需要熟练的专业人员和大量的实验器具。基于细菌核酸的PCR法虽然特异性高、可实现多组分检测，但却需要经过提取核酸和合成特异性引物等复杂的过程。另外，用于检测金黄色葡萄球菌的方法还有基于DNA探针的Southern印迹杂交技术和噻唑蓝比色法等，这些方法虽然特异性强，但灵敏度却非常低，不能实现对金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒及其使用方法，可以快速、方便、特异、灵敏、稳定、低价地检测金黄色葡萄球菌。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1．金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒，包括以下组分：金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽偶联磁珠和异硫氰酸荧光素偶联Magainin I。

Magainin I是非洲爪蛙皮肤颗粒腺中由23个氨基酸组成的短肽，对细菌和真菌有一定的抗菌活性，其作用于细菌表面并具有热稳定性、抗菌谱广、易于合成、稳定性好等优点。

优选的，所述金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽偶联磁珠是将亲和素磁珠与生物素修饰的金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽反应后，再用明胶封闭制得。

优选的，所述生物素修饰的金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽是在金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽的碳端连接3个甘氨酸残基后再修饰生物素。

优选的，所述异硫氰酸荧光素偶联Magainin I是在Magainin I的碳端修饰上异硫氰酸荧光素。

在上述技术方案中，根据要检测的金黄色葡萄球菌的型别，选择该型别金黄色葡萄球菌特异性的噬菌体多肽制备噬菌体多肽偶联磁珠，即可实现对该型别金黄色葡萄球菌的检测。

作为一个优选技术方案，所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923；所述金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽为金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽，其氨基酸序列为Val-Pro-His-Asn-Pro-Gly-Leu-Ile-Ser-Leu-Gln-Gly（SEQ ID No.1）。

进一步，所述试剂盒中还包括以下组分：金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液、反应缓冲液和检测缓冲液。

优选的，所述金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液由以下方法制得：取金黄色葡萄球菌ATCC25923单个菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养，离心去除上清液，细菌用水清洗后，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液重悬并调整细菌浓度；所述反应缓冲液为0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液，所述检测缓冲液为0.01 mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液。

．所述金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒的使用方法，是向待测样品中加入金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽偶联磁珠，孵育，磁性分离，得到金黄色葡萄球菌-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，再加入异硫氰酸荧光素偶联Magainin I，孵育，磁性分离，得到异硫氰酸荧光素偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，检测并记录荧光信号，根据荧光强度求得待测样品中金黄色葡萄球菌的浓度。

作为一个优选技术方案，金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(a) 将金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液用反应缓冲液稀释制成金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液；向金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中加入金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠，孵育，磁性分离，得到金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入异硫氰酸荧光素偶联Magainin I，孵育，磁性分离，得到异硫氰酸偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入检测缓冲液，检测并记录荧光信号，以荧光强度对金黄色葡萄球菌ATCC25923浓度作图，绘制工作曲线；

(b) 向待测样品中加入金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠，孵育，磁性分离，得到金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加异硫氰酸荧光素偶联Magainin I，孵育，磁性分离，得到异硫氰酸荧光素偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入检测缓冲液，检测并记录荧光信号，根据荧光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中金黄色葡萄球菌ATCC25923的浓度。

优选的，金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(a)将金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液用反应缓冲液稀释制成浓度在10~10×10⁵CFU/mL范围内的金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液；向1.0 mL金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中加入10µg金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入5µg/mL异硫氰酸荧光素偶联Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到异硫氰酸荧光素偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入200µL 检测缓冲液，检测并记录荧光信号，以荧光强度对金黄色葡萄球菌ATCC25923浓度作图，绘制工作曲线；

(b) 向1.0 mL待测样品中加入10µg金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入5µg/mL异硫氰酸荧光素偶联Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到异硫氰酸荧光素偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤后，再加入200µL 检测缓冲液，检测并记录荧光信号，根据荧光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中金黄色葡萄球菌ATCC25923的浓度。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒，以金黄色葡萄球菌特异性噬菌体多肽和广谱抗菌肽Magainin I作为细菌识别试剂，结合磁珠快速富集技术和高灵敏的荧光检测方法，针对金黄色葡萄球菌全细胞进行检测，具有快速、方便、特异、灵敏、稳定、低价的优点，有望应用于金黄色葡萄球菌的现场检测和快速筛查，能够为临床诊断、食品安全和环境检测等领域检测金黄色葡萄球菌提供有力的技术支持平台。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒的使用流程示意图。

图2为采用金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒检测金黄色葡萄球菌ATCC25923的工作曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1 金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒的制备

本实施例的金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒，包括以下组分：金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠、异硫氰酸荧光素偶联Magainin I、金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液、反应缓冲液和检测缓冲液。

所述金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠的制备方法为：取亲和素磁珠2mg与生物素修饰的金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽30µg混合，反应，磁性分离，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液洗涤，再加入10µg/mL明胶水溶液1.0mL封闭，磁性分离，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液洗涤，即得。所述金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽的氨基酸序列为Val-Pro-His-Asn-Pro-Gly-Leu-Ile-Ser-Leu- Gln-Gly（SEQ ID No.1）。所述生物素修饰的金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽是在金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽的碳端连接3个甘氨酸残基后再修饰生物素。

所述异硫氰酸荧光素偶联Magainin I是在Magainin I的碳端修饰上异硫氰酸荧光素。

所述金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液的制备方法为：取金黄色葡萄球菌ATCC25923（从广东省微生物菌种保藏中心获得）单个菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养12小时，离心去除上清液，用无菌水清洗细菌2次后，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液重悬细菌并调整细菌浓度至1.0×10⁵ CFU/mL。

所述反应缓冲液为0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液。

所述检测缓冲液为0.01 mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液。

实施例2 金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒的使用方法

如图1所示，实施例1制备的金黄色葡萄球菌ATCC25923的荧光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(a) 将金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液用反应缓冲液稀释制成浓度在10~10×10⁵CFU/mL范围内的金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液；向1.0 mL金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中加入10µg金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠，37℃孵育45分钟，磁性分离，获得金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤，再加入5µg/mL异硫氰酸荧光素偶联Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到异硫氰酸荧光素偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤，再加入200µL 检测缓冲液，检测并记录荧光信号（激发光波长488nm，发射光波长525nm），以荧光强度对金黄色葡萄球菌ATCC25923浓度作图，绘制工作曲线；

(b) 向1.0 mL待测样品中加入10µg金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽偶联磁珠，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤，再加入5µg/mL异硫氰酸荧光素偶联Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分钟，磁性分离，得到异硫氰酸荧光素偶联Magainin I-金黄色葡萄球菌ATCC25923-噬菌体多肽偶联磁珠复合物，用反应缓冲液洗涤，再加入200µL 检测缓冲液，检测并记录荧光信号，根据荧光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中金黄色葡萄球菌ATCC25923的浓度。

上述步骤(a)中，金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液的浓度分别为10、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴和1.0×10⁵ CFU/mL，以荧光强度对金黄色葡萄球菌ATCC25923浓度作图，所得工作曲线如图2所示。随着金黄色葡萄球菌ATCC25923浓度的增加，荧光强度不断增大，二者在10~1.0×10⁵ CFU/mL范围内呈现良好的线性关系，R²=0.9995，检测限（S/N=3）为12 CFU/mL，说明使用本发明的检测试剂盒可以灵敏地检测金黄色葡萄球菌ATCC25923。

上述步骤(a)中，在金黄色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中分别加入6种模式菌（金黄色葡萄球菌CCTCC AB 91093、藤黄微球菌CCTCC AB 91100、表皮葡萄球菌GIM1.444、铜绿假单孢杆菌CCTCC AB 93078、大肠杆菌CCTCC AB 212355和链球菌ATCC35668），然后按上述同样方法进行检测。结果显示，除了表皮葡萄球菌GIM1.444有微弱干扰外，其他5种模式菌对金黄色葡萄球菌ATCC25923的检测均不构成干扰，说明使用本发明的检测试剂盒可以特异地检测金黄色葡萄球菌ATCC25923。

上述步骤(b)中，分别以苹果汁、湖水和健康人尿液作为待测样品，将其高温灭菌后，其中苹果汁和湖水不稀释，健康人尿液用去离子水稀释十倍，向其中添加已知浓度的金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液，然后按上述同样方法进行检测。结果如表1所示，3种待测样品中金黄色葡萄球菌ATCC25923的加标回收率为81%~105%，RSD值不高于5.1%，说明使用本发明的检测试剂盒可以准确地检测金黄色葡萄球菌ATCC25923。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 金黄色葡萄球菌的荧光检测试剂盒及其使用方法

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 金黄色葡萄球菌ATCC25923特异性噬菌体多肽

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Val Pro His Asn Pro Gly Leu Ile Ser Leu Gln Gly

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