一种烟草中新植二烯的提取纯化和检测方法及其应用与流程

本发明属于烟草
技术领域：
，涉及烟草中新植二烯的提取纯化和检测方法及其应用。
背景技术：
：标准物质(ReferenceMaterial,RM),是一种已经充分地确定了其一种或几种特性，用于校准测量器具，评价测量方法或确定材料特性量值的物质。标准物质已成为分析中传递准确度的基准物质和实验室分析质量控制的重要工具，是量值溯源的重要手段，保证了不同时间与空间测量结果的可比性、一致性。目前，烟草中绝大部分香气物质及其前体物的定量分析基本能全部实现，但仍有少部分香气物质没有标准物质或标准物质价格昂贵使常规检测分析难以承受(如新植二烯)，在进行分析时只能采取半定量模式，制约了烟草中香气物质研究的深入开展。新植二烯是一种聚类异戊二烯，具20个碳原子，结构为3-亚甲基-7，11，15-三甲基-1-十六烯，在一个标准大气压下，沸点为344.5±9.0℃，为半挥发性有机化合物。它是由美国学者R.L.Rowland在1957年首次从烤烟中分离出来，并将其命名为新植二烯。后来日本学者I.Onishi和美国学者R.N.GLADDING从白肋烟和卷烟烟气中分离得到新植二烯。新植二烯是烟草中的非色素类萜烯，占烟叶鲜重的0.06％～0.10％。它是烤烟叶绿素降解的产物之一，在成熟和烘烤中，烟叶叶绿素在叶绿素酶的作用下降解产生植醇，约15％～30％的植醇再脱水，便形成新植二烯。新植二烯自身具有清香气且刺激性较强，而叶绿素和叶绿醇则具有青杂气，在调制过程中随着叶绿素和叶绿醇大量转化成新植二烯，烟叶的青杂气消除，进而产生清香气。新植二烯在烟草挥发物性香味物质中含量最高，是烟叶中重要的致香物质。新植二稀还可在醇化过程中发生降解反应生成具有清醇香味的小分子化合物，如植物呋喃等，这些化合物对烤烟清香气的产生具有积极的作用，从而进一步增加了烟叶香气和吃味。另外，新植二烯在烟草燃烧时可直接进入烟气，具有减少刺激性、醇和烟气的作用，同时还可以作为捕集烟气气溶胶内香气成分的载体，具有携带烟叶中挥发性香气成分物质进入烟气的能力，因而是烟叶的重要增香剂。烟叶中新植二烯含量的高低是遗传因素、生态环境和栽培措施共同作用的结果。叶片中新植二烯的含量在基因型和烟叶各部位间存在着较大的差异，不仅与地区、海拔、光照等生态环境因素密切相关，还受到施肥等一系列栽培措施的影响。新植二烯含量与烟草香型风格也有密切的关系，研究表明清香型烤烟的新植二烯含量显著高于浓香及中间香型的烤烟。它对提高对改善烟草香气品质、合理利用烟叶原料具有重要的意义，因此对烟叶中新植二烯的含量进行准确测定很有必要。目前烟草及烟草制品中新植二烯检测所用到的新植二烯的标准品是化工合成的，价格高昂，而且化工合成的新植二烯是一种单体及二聚体的混合物，而实际上烟草中的新植二烯是以单体形式存在的，因此使用化工合成的新植二烯作为标准物质在测量时并不准确。技术实现要素：基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种烟草中新植二烯的提取纯化方法，解决新植二烯标准品价格昂贵，进口标物订购时间长等问题，为萜类香味物质的分离纯化提供依据，有利于烟草中香气物质及前体物质的定量分析，进而促进烟草中香味物质的研究。为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：首先，本发明公开了一种烟草中新植二烯的提取纯化方法，所述提取纯化方法包括如下步骤：(1)向烟草样品中加入卤化烃类有机溶剂进行超声处理，超声处理期间间隔震荡若干次，过滤得粗提液；(2)将步骤(1)得到的粗提液进行旋蒸浓缩处理，加入卤化烃类有机溶剂溶解将样品转移至硅胶上进行拌样处理，然后再转移至硅胶柱中进行上样处理；(3)使用洗脱剂进行洗脱处理，收集洗脱液；(4)将步骤(3)得到的洗脱液旋蒸浓缩近干，使用醇类有机溶剂溶解后过有机相滤膜并用制备色谱进一步纯化；(5)将步骤(4)制备色谱分离纯化后的溶液旋蒸浓缩并用卤化烃类有机溶剂反提除水得新植二烯样品。优选的，所述步骤(1)中，烟草样品与卤化烃类有机溶剂的质量体积比为1g：8-10ml，进一步优选的，所述烟草样品与卤化烃类有机溶剂的质量体积比为1g：10ml；所述卤化烃类有机溶剂为分析纯二氯甲烷；优选的，所述步骤(1)中，超声处理条件为：超声频率为18-20KHz，超声处理时间共计0.5-1h，超声处理期间每隔10min震荡一次；优选的，所述步骤(2)中，旋蒸处理温度为30-35℃，卤化烃类有机溶剂为分析纯二氯甲烷；拌样处理中的硅胶目数为100-200目；所述样品净含量与所述硅胶的质量比为1:1；所述硅胶柱目数为100-200目；所述硅胶柱中硅胶目数为200-300目；优选的，所述步骤(3)中，洗脱剂为石油醚；洗脱处理具体为：第一个柱体积洗脱液舍弃(洗脱液可用于下一次的洗脱，重新富集新植二烯)，收集后两个柱体积洗脱液；优选的，所述步骤(4)中，旋蒸处理温度为30-35℃；醇类有机溶剂为色谱纯甲醇；有机相滤膜规格为0.45μm有机相滤膜；优选的，所述步骤(4)中，制备色谱进一步纯化所采用的条件为：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸；0min,A:B＝90：10；6min，A:B＝98：2；9min，A:B＝90：10；12min，A:B＝90：10；进样量为2mL，扫描波长220-260nm，收集4.2min-5.4min之间的组分。优选的，所述步骤(5)中，旋蒸处理温度为30-35℃，卤化烃类有机溶剂为色谱纯二氯甲烷。本发明还公开了一种由上述提取纯化方法制备得到的新植二烯。此外，本发明公开了一种上述新植二烯的检测方法，所述方法采用气相色谱分析检测，检测条件为：色谱柱DB-5弹性毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；火焰离子化检测器(FID)；进样口：250℃；初始温度80℃，保持0min，以20℃/min速率升至300℃，保持15min，以2℃速率升至310℃，保持15min，总运行时间为46min。最后，本发明公开了上述新植二烯作为标准物质在烟草香气物质及其前体物的定量分析中的应用。本发明的有益效果：(1)初烤烟叶中新植二烯含量丰富，本方法以初烤烟叶为原料直接进行提取，取材方便、廉价易得。(2)与化学合成相比，本方法步骤少、操作简单、成本低，仅使用一步超声萃取、硅胶柱初步分离纯化后经反相制备色谱即可得到纯度极高的新植二烯样品，经分析检测，本发明制备得到的新植二烯纯度高达99.42％。(3)本方法制得的新植二烯纯度远高于市面所售新植二烯纯度，且不含新植二烯二聚体，因此作为标准物质进行烟草香气物质及其前体物的定量分析时更为准确。附图说明图1为新植二烯标准品(200μg/mL)气相色谱图；图2为新植二烯粗提物气相色谱图；图3为新植二烯凝胶柱分离纯化气相色谱图；图4为新植二烯纯化制备后气相色谱图。具体实施方式结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例11、仪器与试剂：美国安捷伦6890N气相色谱仪；美国WatersPrep150制备色谱；旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；氮吹仪；BS214S分析天平(德国Sartorius公司)；玻璃柱(40×650mm)。分析纯二氯甲烷(国药)；分析纯石油醚(60-90℃，国药)；色谱纯二氯甲烷(德国默克)；色谱纯甲醇(德国默克)；蒸馏水，符合GB/T6682中一级水的要求。2、样品提取及初步分离：(1)新植二烯提取：称20g的烟末于300mL的锥形瓶中，加入200mL分析纯二氯甲烷，封口膜封口，超声频率为18kHz，超声30min，期间每隔10min震荡一次，滤纸过滤于250mL平底烧瓶中得新植二烯粗提物。(2)硅胶柱装柱：柱子清洗烘干备用，柱子底部用少量棉花塞住，松紧适度，后用铁架台固定并与水平面垂直，于1000mL烧杯中加入150g的300目的硅胶，用石油醚调成匀浆，注入柱子，并用洗耳球轻轻敲打柱身，沉降约2h，待用。(3)拌样：将步骤1得到的粗提液在35℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干，分三次依次加入2mL分析纯的二氯甲烷，将样品完全转移到与其净重1:1的100目硅胶上，并充分搅拌挥干，待用。(4)上样：将步骤3拌好的样品通过漏斗加入步骤(2)的柱子中沉降，并用石油醚将研钵和漏斗冲洗干净，使样品全部转移到柱子中。(5)洗脱：将步骤4上样后的柱子中加入适量的棉花保护样品面，然后用石油醚进行洗脱，其中第一个柱体积洗脱液舍弃(洗脱液可用于下一次的洗脱，重新富集新植二烯)，收集并合并后两个柱体积洗脱液。3、制备色谱的进一步纯化：(1)将上述步骤(5)的洗脱液在35℃旋蒸浓缩近干，用色谱纯甲醇进行溶解，过0.45μm有机相滤膜，用制备色谱进一步纯化(制备色谱进一步纯化所采用的条件为：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸；0min,A:B＝90：10；6min，A:B＝98：2；9min，A:B＝90：10；12min，A:B＝90：10；)，进样量为2mL，扫描波长220-260nm，收集4.2min-5.4min之间的组分。(2)将步骤(1)制备色谱所分离纯化的样品35℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩，经色谱纯二氯甲烷反提除水后得新植二烯样品。实施例21、仪器与试剂：美国安捷伦6890N气相色谱仪；美国WatersPrep150制备色谱；旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；氮吹仪；BS214S分析天平(德国Sartorius公司)；玻璃柱(40×650mm)。分析纯二氯甲烷(国药)；分析纯石油醚(60-90℃，国药)；色谱纯二氯甲烷(德国默克)；色谱纯甲醇(德国默克)；蒸馏水，符合GB/T6682中一级水的要求。2、样品提取及初步分离：(1)新植二烯提取：称20g的烟末于300mL的锥形瓶中，加入160mL分析纯二氯甲烷，封口膜封口，超声频率为20kHz，超声60min，期间每隔10min震荡一次，滤纸过滤于250mL平底烧瓶中得新植二烯粗提物。(2)硅胶柱装柱：柱子清洗烘干备用，柱子底部用少量棉花塞住，松紧适度，后用铁架台固定并与水平面垂直，于1000mL烧杯中加入150g的300目的硅胶，用石油醚调成匀浆，注入柱子，并用洗耳球轻轻敲打柱身，沉降约2h，待用。(3)拌样：将步骤1得到的粗提液在35℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干，分三次依次加入2mL分析纯的二氯甲烷，将样品完全转移到与其净重1:1的200目硅胶上，并充分搅拌挥干，待用。(4)上样：将步骤3拌好的样品通过漏斗加入步骤(2)的柱子中沉降，并用石油醚将研钵和漏斗冲洗干净，使样品全部转移到柱子中。(5)洗脱：将步骤4上样后的柱子中加入适量的棉花保护样品面，然后用石油醚进行洗脱，其中第一个柱体积洗脱液舍弃(洗脱液可用于下一次的洗脱，重新富集新植二烯)，收集并合并后两个柱体积洗脱液。3、制备色谱的进一步纯化：(1)将上述步骤(5)中的洗脱液在35℃旋蒸浓缩近干，用10ml色谱纯甲醇进行溶解，过0.45μm有机相滤膜，用制备色谱进一步纯化(制备色谱进一步纯化所采用的条件为：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸；0min,A:B＝90：10；6min，A:B＝98：2；9min，A:B＝90：10；12min，A:B＝90：10；)，进样量为2mL，扫描波长220-260nm，收集4.2min-5.4min之间的组分。(2)将步骤1制备色谱所分离纯化的样品35℃旋蒸浓缩，经色谱纯二氯甲烷反提除水后得新植二烯样品。实验例为进一步验证本申请技术方案，购买市面上销售的新植二烯标准品(气相色谱图如图1所示，各组分面积百分比如表1所示)作对比进行实验验证。表1新植二烯标准品面积百分比保留时间/min峰面积/(Pa*s)峰面积/％8.0334.15E-010.318.1151.13E+0284.988.2421.95E+001.478.3341.08E+000.828.4421.65E+0112.42具体实施方式如下：1、仪器与试剂：美国安捷伦6890N气相色谱仪；美国WatersPrep150制备色谱；旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；氮吹仪；BS214S分析天平(德国Sartorius公司)；玻璃柱(40×650mm)。分析纯二氯甲烷(国药)；分析纯石油醚(60-90℃，国药)；色谱纯二氯甲烷(德国默克)；色谱纯甲醇(德国默克)；蒸馏水，符合GB/T6682中一级水的要求。2、新植二烯气相色谱检测条件：色谱柱DB-5弹性毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；火焰离子化检测器(FID)；进样口：250℃；初始温度80℃，保持0min，以20℃/min速率升至300℃，保持15min，以2℃速率升至310℃，保持15min，总运行时间为46min。3、样品提取及初步分离：(1)新植二烯提取：称20g的烟末于300mL的锥形瓶中，加入200mL分析纯二氯甲烷，封口膜封口，超声45min，期间每隔10min震荡一次，滤纸过滤于250mL平底烧瓶中，取1mL于35℃水浴的氮吹浓缩近干，用1mL的色谱纯二氯甲烷进行溶解，过0.45μm有机相滤膜，用气相色谱(FID检测器)进行纯度的检测，其余粗提液待纯化。气相色谱结果显示，共检测出67种物质，其中新植二烯占16.8％。虽然新植二烯的相对含量最高，但其他杂质高达66种，占总量的83.2％。分析结果见图2、表2。表2新植二烯粗提液面积百分比(2)硅胶柱装柱：柱子清洗烘干备用，柱子底部用少量棉花塞住，松紧适度，后用铁架台固定并与水平面垂直，于1000mL烧杯中加入150g的300目的硅胶，用石油醚调成匀浆，注入柱子，并用洗耳球轻轻敲打柱身，沉降约2h，待用。(3)拌样：将步骤1得到的粗提液在35℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干，分三次依次加入2mL分析纯的二氯甲烷，将样品完全转移到与其净重1:1的100目硅胶上，并充分搅拌挥干，待用。(4)上样：将步骤3拌好的样品通过漏斗加入步骤(2)的柱子中沉降，并用石油醚将研钵和漏斗冲洗干净，使样品全部转移到柱子中。(5)洗脱：将步骤4上样后的柱子中加入适量的棉花保护样品面，然后用石油醚进行洗脱，第一个半柱体积舍弃，后3.5个柱体积分为7个半柱体积分别收集到250mL的平底烧瓶中，待进一步纯化。(6)将步骤5得到的洗脱液在35℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩近干，分别用3mL的色谱纯二氯甲烷溶解，并重复两遍，使分离到的样品完全转移到10mL样品瓶中，待用。(7)将步骤6得到的7个半柱体积目标物的二氯甲烷溶液，以及200ug/mL新植二烯的标准品，分别取1mL过0.45μm有机相滤膜，用气相色谱(FID检测器)进行浓度和纯度的检测，确定洗脱体积。气相色谱检测结果显示：200ug/mL新植二烯标准品检测纯度显示为84.98％，8.442min的色谱峰经谱库检索为新植二烯二聚体，峰面积占12.42％；第2个半柱体积新植二烯的峰面积为2.9E-1，纯度为0.052％，其浓度和纯度都很低，应舍弃。第7和第8个半柱体积新植二烯虽然纯度达到了57％，但浓度最高不足标准品的一半，考虑到成本，应舍弃(其洗脱液用于下一次的洗脱，重新富集新植二烯)。第3-6个半柱体积其纯度都在48％以上，最大的浓度达到了标准品的15倍，最小浓度也大于标准品，所以确定收集的柱体积为第3-6个半柱体积，即第2和第3个柱体积。分析结果见表5。以第四个半柱体积为例，粗提液经硅胶柱纯化后杂质由前面的66种降低为34种，新植二烯的含量也由16.78％纯化到56.17％。分析结果见图3、表3。表3新植二烯凝胶柱分离纯化面积百分比4、制备色谱的进一步纯化：(1)将第2和第3个柱体积的二氯甲烷溶液合并后35℃水浴的氮吹浓缩近干，用适量的色谱纯甲醇进行溶解，过0.45μm有机相滤膜，用制备色谱进一步纯化，收集4.2min-5.4min之间的组分。(2)将步骤1制备色谱所分离纯化的样品35℃水浴的旋转蒸发仪中浓缩，经色谱纯二氯甲烷反提除水后，用气相色谱(FID检测器)检测其纯度。如图4、表4所示，气相色谱检测结果显示，新植二烯经制备色谱进一步纯化后，杂质由硅胶柱分离后的34种降低到1种，新植二烯的纯度达到99.42％，相比标准品的84.98％提高了14.44％。表4新植二烯制备纯化面积百分比保留时间/min峰面积/(Pa*s)峰面积/％8.112112.0699.428.6750.660.58上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。当前第1页1 2 3