本发明涉及细菌性阴道炎检测试剂领域，具体涉及一种脯氨酸氨基肽酶检测试剂、反应垫及试剂盒。
背景技术：
阴道炎是阴道黏膜及黏膜下结缔组织的炎症，是妇科门诊常见的疾病。正常健康妇女，由于解剖学及生物化学特点，阴道对病原体的侵入有自然防御功能，当阴道的自然防御功能遭到破坏，则病原体易于侵入，导致阴道炎症。常见的阴道炎有细菌性阴道炎(BV/AV)、霉菌性阴道炎(VVC)及滴虫性阴道炎(TV)三大类。其中，女性细菌性阴道感染可分为两种，一种由厌氧菌和兼性厌氧菌引起，临床上称细菌性阴道病(BV)，另一种由需氧菌引起，临床上称需氧菌性阴道炎(AV)。两种细菌性阴道炎的病原体不同，临床症状、治疗方案和结局也不相同，区别这两种细菌性阴道感染，在阴道感染的诊疗中具有重要意义。BV是指一类在生殖学上正常菌群(产H2O2乳酸杆菌)减少，代之以加德纳菌、厌氧菌，动弯杆菌大量繁殖，阴道内生态平衡系统改变引起的一类疾病。脯氨酸氨基肽酶是由加德纳菌和动弯杆菌产生，是BV相关病原体所分泌的特异性标志酶，故阴道分泌物中存在脯氨酸氨基肽酶即可针对BV。但目前用于检测脯氨酸氨基肽酶的检测试剂其精确度有所欠缺。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种脯氨酸氨基肽酶检测试剂，该检测试剂通过添加二硫苏糖醇(DTT)和牛血清白蛋白(BSA)特异增强脯氨酸氨基肽酶活性的稳定性，检测更加准确。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种脯氨酸氨基肽酶检测试剂：包括二硫苏糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺、牛血清白蛋白和Tris-Hcl缓冲液。
作为优选，所述脯氨酸氨基肽酶检测试剂中的成分按重量份计包括：
其中，牛血清白蛋白占脯氨酸氨基肽酶检测试剂的体积百分比0.5～10％；
Tris-Hcl缓冲液的摩尔浓度为0.01～1mol/L。
再优选地，所述脯氨酸氨基肽酶检测试剂中的成分按重量份计包括：
其中，牛血清白蛋白占脯氨酸氨基肽酶检测试剂的体积百分比2％；
Tris-Hcl缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L。
作为优选，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮-K90。
作为优选，使用所述脯氨酸氨基肽酶检测试剂进行检测的样品的稀释液为生理盐水。
本发明的第二个目的是为了提供一种反应垫，该反应垫使用方便快捷，精确性高。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种反应垫，包括载体和如上所述的脯氨酸氨基肽酶检测试剂的成分；所述脯氨酸氨基肽酶检测试剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测脯氨酸氨基肽酶。
作为优选，使用所述反应垫进行检测的样品的稀释液为生理盐水。
本发明的第三个目的是为了提供一种反应垫的制备方法，通过该制备方法结合检测试剂的成分获得一种灵敏度高、精确度高的反应垫。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的反应垫的制备方法，包括以下步骤：
1)制备浸泡液：将二硫苏糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺和牛血清白蛋白溶于Tris-Hcl缓冲液中，得到浸泡液；
2)浸泡液处理：将载体置于浸泡液中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到反应垫。
作为优选，步骤2)中，所述载体置于浸泡液中充分浸泡10～20s。
作为优选，步骤2)中，所述干燥的温度为20～75℃，时间为30～40min。
作为优选，所述载体为滤纸。
本发明的第四个目的是为了提供一种试剂盒，该试剂盒用于检测脯氨酸氨基肽酶，使用方便灵活。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种试剂盒，包括如上所述的反应垫；所述试剂盒用于检测脯氨酸氨基肽酶。
本发明的设计原理如下：
当阴道分泌物中正常菌群(产H2O2乳酸杆菌)减少，代之以加德纳菌、厌氧菌，动弯杆菌大量繁殖时，加德纳菌和动弯杆菌产生脯氨酸氨基肽酶，脯氨酸氨基肽酶水解Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺，对硝基苯胺呈现黄色；二硫苏糖醇和牛血清白蛋白辅助增强脯氨酸氨基肽酶活性的稳定性，使得检测结果准确。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测试剂通过添加二硫苏糖醇和牛血清白蛋白特异增强脯氨酸氨基肽酶活性的稳定性，检测更加准确；
2、本发明的反应垫可使用生理盐水作为检测样品的稀释液，使用条件简单方便，并可结合使用条件相同的其他菌种预成酶的检测反应垫同时对样品进行检测，效率更高；
3、本发明的反应垫制备方法最大限度地将检测试剂的成分包被在反应垫中，获得的反应垫灵敏度高，精确性好。
附图说明
图1为实施例7的显色结果示意图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种脯氨酸氨基肽酶检测试剂，按重量份计包括以下成分：
其中，牛血清白蛋白占脯氨酸氨基肽酶检测试剂的体积百分比0.5～10％；
Tris-Hcl缓冲液的摩尔浓度为0.01～1mol/L。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，体积百分数为5％的水溶液(aq)，其粘度为39.5～45.8mPas。
脯氨酸氨基肽酶检测试剂通过以下制备方法制得：
将二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺和牛血清白蛋白(BSA)依次溶于Tris-Hcl缓冲液中，得到脯氨酸氨基肽酶检测试剂。
一种反应垫，包括载体和如上所述的脯氨酸氨基肽酶检测试剂的成分；所述脯氨酸氨基肽酶检测试剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测脯氨酸氨基肽酶；使用该反应垫进行样品检测时，样品的稀释液为生理盐水。
该反应垫的制备方法包括以下步骤：
1)备料：按以上重量份准备二硫苏糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺和牛血清白蛋白；
2)配制缓冲液：配制0.01mol/L～1mol/L的Tris-Hcl缓冲液；
3)制备浸泡液：将二硫苏糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺和牛血清白蛋白溶于Tris-Hcl缓冲液中，得到浸泡液；
4)浸泡液处理：将滤纸置于浸泡液中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为20～75℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到反应垫。
更具体地，所述滤纸可以是Whatman玻璃纤维滤纸、GF/A Whatman的纤维滤纸Grade3或普通定量滤纸。
应用反应垫制备试剂盒：将反应垫置于试剂盒的反应孔中，然后将反应孔密封，得到试剂盒；试剂盒置于2～8℃中保存。
实施例1～3
实施例1～3公开了脯氨酸氨基肽酶检测试剂，按表1的分别准备三组原料成分，按表2准备浓度不同的Tris-Hcl缓冲液；A组用于实施例1，B组用于实施例2，C组用于实施例3。
将二硫苏糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺和牛血清白蛋白依次溶于100mL的Tris-Hcl缓冲液中，得到脯氨酸氨基肽酶检测试剂。
表1检测试剂的成分及含量
表2 Tris-Hcl缓冲液的配制参数
对实施例1～3中获得的检测试剂进行检测：分别制备酶活性浓度不同的脯氨酸氨基肽酶标准品溶液，脯氨酸氨基肽酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例1～3的灵敏度。
分别取实施例1～3的脯氨酸氨基肽酶检测试剂各1mL，然后分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴8～10min，然后观察溶液中的颜色变化，溶液显色为黄色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表3所示：
表3实施例1～3的检测结果
+表示阳性，-表示阴性。
实施例1～3均可检测脯氨酸氨基肽酶，且当脯氨酸氨基肽酶活性较低时仍然能够检测到脯氨酸氨基肽酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例1仍可检测得到少量的脯氨酸氨基肽酶，实施例1检测试剂的灵敏度最高。
实施例4～6
实施例4～6公开了一种反应垫及其制备方法：
1)按表1进行备料，按表2配制Tris-Hcl缓冲液；A组用于实施例4，B组用于实施例5，C组用于实施例6；
2)制备浸泡液：将二硫苏糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-对硝基苯胺和牛血清白蛋白溶于Tris-Hcl缓冲液中，得到浸泡液；
3)浸泡液处理：将滤纸置于浸泡液中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为45℃，时间40min的条件下进行干燥，得到反应垫。
对实施例4～6中获得的反应垫进行检测：分别制备酶活性浓度不同的脯氨酸氨基肽酶标准品溶液，脯氨酸氨基肽酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例4～6的灵敏度；在实施例4～6的反应垫中分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴8～10min，然后观察反应垫中的颜色变化，反应垫显色为黄色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表5所示：
表4实施例4～6的检测结果
+表示阳性，-表示阴性。
实施例4～6的反应垫均可检测脯氨酸氨基肽酶，且当脯氨酸氨基肽酶活性较低时仍然能够检测到脯氨酸氨基肽酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例4仍可检测得到少量的脯氨酸氨基肽酶，实施例4的反应垫灵敏度最高。
实施例7
在实施例4中，浸泡液采用盐酸缓冲液、双甘氨肽-Tris-Hcl溶液、2％吐温、生理盐水替代二硫苏糖醇，并采用与实施例4～6相同的脯氨酸氨基肽酶标准品溶液进行检测；检测结果如表5所示：
表5采用不同试剂替代二硫苏糖醇所得到的反应垫的检测结果
+表示阳性，-表示阴性。
结果显示：添加二硫苏糖醇的反应垫的灵敏度最高，在酶活性浓度为3.75U/mL时仍然能够检测得到。
实施例8
本实施例将实施例4得到和对比例的反应垫置于不同的保存条件，检测其稳定性，对比例为未添加牛血清白蛋白的反应垫；处理后采用与实施例4～6相同的检测方法进行检测，反应垫的显色结果如图1所示，图示中的空白对照为生理盐水，结果如表6所示：
表6不同条件下处理后的反应垫灵敏度检测结果
+表示阳性，-表示阴性。
检测结果显示，冷藏保存反应垫可以使反应垫更加稳定，而添加了牛血清白蛋白的反应垫比未添加牛血清白蛋白的反应垫更加灵敏，表明牛血清白蛋白提高了反应垫的稳定性。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。