一种B族维生素的检测方法与流程

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种B族维生素的检测方法。

背景技术：

维生素是维护人体健康、促进生长发育和调节生理功能所必需的一类有机化合物。这些化合物都存在于天然食物中，一般在体内不能合成或合成量较少，不能满足需要。由于饮食习惯和缺乏营养知识，以及现代人生活方式改变，难以达到理想的平衡膳食模式，据权威部门调查，中国多数人日常饮食不能均衡提供某些维生素和矿物质，缺钙、铁、维生素A、B2比较普遍，缺锌、硒、维生素B₁、维生素C也很常见。因此有必要服用营养素补充剂。

多种维生素缓释胶囊是通过亲水凝胶骨架达到缓释的效果，口服后遇消化液发生水化作用生成凝胶，其中的B族维生素通过扩散和凝胶骨架溶蚀的方式释放。亲水凝胶骨架不容易完全溶解，从而造成B族维生素含量测定难度大。经试验，目前已报道文献的方法均不能测定多种维生素缓释胶囊的中的维生素B₁、B₂、B₃、B₅、B₆、B₇、B₁₂。

在保健食品的生产、贮藏、供应和临床使用等各个环节，为确保保健食品质量，均需经过严格的分析检验，以此来保证保健食品的安全有效合理。因此，进一步开发多种维生素缓释胶囊中B族维生素的检测方法是非常关键的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种B族维生素的检测方法，本发明采用HPLC-MS联用的方法，可实现对多种维生素缓释胶囊中7种B族维生素的检测，该方法线性范围广，精密度，重复性、稳定性和灵敏度、准确性皆良好，且空白溶液对测定结果无影响。

本发明提供的B族维生素的检测方法，以甲酸水溶液或乙酸水溶液为流动相A相；以甲醇或乙腈为流动相B相；采用高效液相色谱与质谱联用对样品进行检测，根据质谱图和色谱图对B族维生素进行定性和/或定量；

所述高效液相色谱采用梯度洗脱，洗脱程序为：

0～0.5min，流动相A相的体积分数为92％；

0.5min～8min，流动相A相的体积分数由92％降至10％；

8min～8.5min，流动相A相的体积分数为10％；

8.5min～9min，流动相A相的体积分数由10％升至92％；

9min～12min，流动相A相的体积分数为92％。

高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)将HPLC对复杂样品的分离能力与MS具有选择性、灵敏性及能够提供相对分子质量与结构信息的有点结合起来，在药物、食品、保健品或环境分析等多个领域得到了广泛的应用。但在面对需要对一种新的样品进行检测时，需要对HPLC-MS的条件进行摸索，以建立针对该样品的检测方法。新的方法需要进行精密度、重复性和准确度等多方面的鉴定，对本发明提供方法的鉴定结果表明：

线性：线性实验结果表明，维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的相关系数R分别为0.9999、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9997,所以用该方法测定维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12浓度分别为1.57343μg/ml至7.86712μg/ml，1.59031μg/ml至7.95156μg/ml，10.0300μg/ml至50.1498μg/ml，3.21878μg/ml至16.0939μg/ml，1.57642μg/ml至7.88211μg/ml，0.524892μg/ml至2.62446μg/ml，0.534886μg/ml至2.67443μg/ml，之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求(GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99)。

精密度：同一份B族维生素标准工作溶液，连续进样六次，7种B族维生素峰面积的相对标准偏差皆小于0.8％，说明该方法的精密度良好。

重复性：取B族维生素标准工作溶液，由同一分析人员精密称取6份，平行操作测定6份供试品溶液，结果表明，7种B族维生素含量相对标准偏差皆小于0.9％，在规定范围内，说明此本发明提供方法的重复性较好。

稳定性：将B族维生素的标准工作溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后进行检测，7种B族维生素峰面积的相对标准偏差皆小于0.7％，说明该方法的精密度良好。

空白实验表明，对空白溶液的检测谱图中，在维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的出峰时间处均无峰，表明空白对测定结果基本无干扰。

准确度：在样品中加入已知量的标准品，以本发明提供的方法对B族维生素的进行定量，计算加样回收率。每组浓度平行三次检测回收率，计算平均值，结果表明，7种B族维生素回收率位于99.1％～100.1％，符合回收率要求。说明该方法具有良好的准确度。

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相对样品具有一定的溶解能力且与样品不产生化学反应，其黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；且流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用紫外检测器，则应使用对紫外吸收较低的溶剂配制。其沸点不可以太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。对于B族维生素而言，以本发明提供的流动相进行等度洗脱能够保证更好的检测效果，优于其他流动相的检测结果。

在本发明中，甲酸水溶液中，甲酸的体积分数为0.1％；所述乙酸水溶液中，乙酸的体积分数为0.1％。

一些具体实施例中，流动相A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。

在另一些实施例中，流动相A相为体积分数为0.1％的乙酸水溶液。

在本发明中，高效液相色谱流动相的流速为0.3mL/min～0.5mL/min。

一些具体实施例中，高效液相色谱流动相的流速为0.5mL/min。

对柱温的选择需考虑待分离物质本身的特性，柱温影响流动相对待测物质的溶解度也会影响柱压。一般情况下，提高柱温有利于提高分离度，但温度过高会导致柱压过低，不利于物质的检出。

本发明中，高效液相色谱的色谱柱的柱温为30℃～40℃。

一些具体实施例中，高效液相色谱的色谱柱的柱温为40℃。

高效液相色谱的进样量为1～5μL，优选为2μL。

对本发明提供的方法而言，根据B族维生素的极性选择C18色谱柱。色谱柱的尺寸会对分离结果产生影响，其内径会对流动相的流速产生影响，长度较短的色谱柱运行时间短，柱压较低；长度较长的色谱柱分辨率稿，但运行时间增长。

本发明中，高效液相色谱的色谱柱为C18色谱柱，尺寸为100×4.6mm，2.6μm；150×4.6mm，2.7μm或100×4.6mm，3μm。

一些实施例中，色谱柱为Phenomenex,Kinetex,XB-C18,(100×4.6mm，2.6μm)；Agilent,EC-C18,(150×4.6mm，2.7μm)；或Phenomenex,Luna,C18(2),(100×4.6mm，3μm)。

一个具体实施例中，色谱柱为Phenomenex,Kinetex,XB-C18,(100×4.6mm，2.6μm)。

本发明中，质谱的离子源为电喷雾正离子源；离子源温度为600℃。

本发明中，质谱的电喷雾电压为5500V；碰撞气压7.0psi；气帘气压22.0psi；雾化气压60.0psi；辅助气流速20.0psi。

对不同B族维生素的检测参数如表1：

表1质谱参数

其中，母离子(Q1)、定量定性离子对(Q3)、去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞池入口电压(CEP)、碰撞气能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)。

样品的前处理方式对检测结果同样影响显著，不当的前处理会导致检测失败。

本发明样品进样前经前处理，所述前处理的方式为：以水为溶剂对粉碎后的样品进行超声提取，经离心后过滤除菌；所述超声提取的时间为20～40min；温度为10～30℃功率为0.8～1.1KW，频率为37～45KHz。

前处理过程中，水与样品的质量-体积比为(90mg～180mg)：(500mL～1000mL)。

超声的时间为30min。

离心的转速为8000r/min；时间为4～8min。优选离心5min。

离心后取上清液过滤除菌，滤径为0.22μm。

本发明提供的检测方法在对保健品中B族维生素检测中的应用。

本发明提供方法适用的保健品为多种维生素缓释胶囊。

所述多种维生素缓释胶囊中辅料包括：海藻酸钠、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮。

实验表明，采用本发明提供的方法对多种维生素缓释胶囊进行检测，其中的辅料成分的检出峰不会对B族维生素产生干扰，本发明提供的方法具有良好的准确性、精密度、稳定性和重复性。

附图说明

图1～7依次示维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的标准曲线；

图8～14依次示维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的标品与纯净水的色谱图对比；其中图8-a～图14-a示维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的标品的色谱图，图8-b～图14-b示纯净水的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种B族维生素的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器和试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中：

仪器为安捷伦1260高效液相色谱仪-API3200质谱仪(配ESI离子源)。

试剂试药：甲酸(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；一级用水；维生素B1-硝酸硫胺素(来源：SUPELCO，批号:LB84083V，纯度:99.9％)；维生素B2-核黄素(来源：Dr.，批号:31106，纯度:98.9％)；维生素B3-烟酰胺(来源：SUPELCO，批号:LC01839V，纯度:99.9％)；维生素B5-泛酸钙(来源：SUPELCO，批号:LC11592V，纯度:99.9％)；维生素B6-盐酸吡哆醇(来源：SUPELCO，批号:LB83988V，纯度:99.9％)；维生素B7-生物素(来源：中国食品药品检定研究院，批号:100291-201303，纯度:99.6％)；维生素B12-钴胺素(来源：中国食品药品检定研究院，批号:100248-201203，纯度:90.2％)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

高效液相色谱仪条件：

流动相：A：0.1％甲酸溶液，B：甲醇，梯度洗脱；

流速：0.5ml/min；

柱温：40℃；

色谱柱：Phenomenex,Kinetex,XB-C18，100×4.6mm，2.6μm。

质谱参数如表1：

表1质谱参数

离子源温度为600℃，质谱的电喷雾电压为5500V；碰撞气压7.0psi；气帘气压22.0psi；雾化气压60.0psi；辅助气流速20.0psi。

分别精密称取硝酸硫胺素5.25mg，核黄素5.36mg，烟酰胺5.02mg，泛酸钙5.37mg，盐酸吡哆醇5.26mg，生物素5.27mg，钴胺素5.93mg，分别置于50ml棕色容量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在4℃的冰箱中储存备用。(注：核黄素需先加少量盐酸溶液溶解后，再加水定容。)

分别精密吸取硝酸硫胺素储备液3.00ml，核黄素储备液3.00ml，烟酰胺储备液20.00ml，泛酸钙储备液6.00ml，盐酸吡哆醇储备液3.00ml，生物素储备液1.00ml，钴胺素储备液1.00ml，置于100ml棕色容量瓶中，加入水定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，分别精密吸取工作溶液1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，进行分析测定，绘制标准工作曲线。结果如表2：

表2：试验数据

线性评价：维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的相关系数R分别为0.9999、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9998、0.9997,所以用该方法测定维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12浓度分别为1.57343μg/ml至7.86712μg/ml，1.59031μg/ml至7.95156μg/ml，10.0300μg/ml至50.1498μg/ml，3.21878μg/ml至16.0939μg/ml，1.57642μg/ml至7.88211μg/ml，0.524892μg/ml至2.62446μg/ml，0.534886μg/ml至2.67443μg/ml，之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99】。

实施例2

分别精密吸取硝酸硫胺素储备液3.00ml，核黄素储备液3.00ml，烟酰胺储备液20.00ml，泛酸钙储备液6.00ml，盐酸吡哆醇储备液3.00ml，生物素储备液1.00ml，钴胺素储备液1.00ml，置于100ml棕色容量瓶中，加入水定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，

将维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的标准工作溶液按实施例1条件重复测定6次，计算其峰面积RSD(％)。结果如表3：

表3：精密度

维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12重复测定6次峰面积的RSD分别为0.5％、0.8％、0.7％、0.8％、0.6％、0.7％、0.7％，表明该方法有较好的精密度。

实施例3

精密称取6份多种维生素缓释胶囊中维生素B族缓释片的样品粉末180mg，置于50ml离心管中，精密加入50.00ml水超声搅拌溶解，约30min，放冷至室温，8000r/min离心5min，经0.22μm的水相滤膜过滤，即得测定供试液。进样2μl，按实施例1检测条件检测样品含量，

样品含量计算公式为：

X＝C×V/M×K

式中：X—样品中维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的含量，g/100g；

M—样品的质量，g；

K—单位转换系数(K＝0.0001)；

V—样品的稀释倍数，ml；

C—样品溶液中维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的浓度，μg/ml。

注：泛酸钙转化成泛酸的系数0.92，计算泛酸对照溶液浓度时需乘上。

计算其峰面积RSD(％)。结果如表4：

表4重复性

6份样品维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12含量的RSD分别为0.7％、0.8％、0.9％、0.8％、0.8％、0.6％、0.7％，表明该方法有较好的重复性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤2.7％】。

实施例4

分别精密吸取硝酸硫胺素储备液3.00ml，核黄素储备液3.00ml，烟酰胺储备液20.00ml，泛酸钙储备液6.00ml，盐酸吡哆醇储备液3.00ml，生物素储备液1.00ml，钴胺素储备液1.00ml，置于100ml棕色容量瓶中，加入水定容至刻度，摇匀，即得工作溶液。将工作溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，按实施例1检测条件测定峰面积，计算其RSD(％)。结果如表5：

表5稳定性

维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12标准工作溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、8h、12h后，RSD分别为0.5％、0.7％、0.7％、0.6％、0.6％、0.7％、0.7％，表明维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12标准工作溶液在室温下12小时内的稳定性良好。

实施例5

取纯净水作为检测样品，将纯净水经超声30min后，经0.22μm的水相滤膜过滤，即得完全释放的供试液。进样2μl。与维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12标准工作溶液的出峰时间对比。结果如图8～14。

结果表明，空白溶液在维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的出峰时间处均无峰，表明空白对测定结果基本无干扰。

实施例6

分析方法检出限由信噪比(S/N)计算。当信噪比(S/N)为3时，检出限为维生素B1:0.62937ng/ml；维生素B2:0.63612ng/ml；维生素B3:4.01198ng/ml；维生素B5:1.28751ng/ml；维生素B6:0.63057ng/ml；维生素B7:10.49780ng/ml；维生素B12:10.69770ng/ml。

实施例7

加标：精密称取约0.18g样品9份(已知样品的维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12含量分别为：1.215％、1.066％、11.948％、2.732％、1.218％、0.528％、2.526mg/100g)，分成3组，每组3份，各组分别精密加入硝酸硫胺素，核黄素，烟酰胺，泛酸钙，盐酸吡哆醇，生物素，钴胺素适量。

将待测样品置于50ml离心管中，精密加入50.00ml水超声搅拌溶解，约30min，放冷至室温，8000r/min离心5min，经0.22μm的水相滤膜过滤，进样2μl。按实施例1检测条件测定峰面积，计算其RSD(％)。

测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量

回收率(％)＝测得加入量/理论加入量

结果如表6：

表6回收率

维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的平均回收率分别为：99.1％、99.3％、99.3％、99.8％、100.1％、99.3％、99.5％、，相对标准偏差(RSD)分别为0.8％、0.7％、0.8％、0.6％、0.6％、0.6％、0.5％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95—105％】。

通过对维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对多种维生素缓释胶囊的维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12含量起到质量控制的目的。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。