温敏性生物传感器的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及温敏性生物传感器。

背景技术：

液晶态是一种处于固态晶体和无序液体之间的“软物质态”。液晶分子具有长程有序性和光学各向异性，已被广泛应用于平面显示领域。1998年美国威斯康星大学Abbott研究组首次利用液晶分子构建生物传感器，开辟了液晶应用新领域。液晶生物传感器易于实现微型化和阵列化，具备结构简单、检测简便快速等优点，在生命科学、临床医学和食品安全领域展现了广阔的应用前景。目前液晶液滴温度传感器，存在液晶液滴的取向变化不明显，温度敏感性差的问题。

由此，液晶液滴构成的温敏性生物传感器有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种温敏性生物传感器，该传感器通过控制连接DNA的聚合和解聚反映温度的变化，当温度升高超过预定温度，即连接DNA熔点，连接DNA会出现断裂从而导致液晶液滴从团聚状态变为分散状态，当温度低于预定温度时，液晶液滴又会从分散状态转变为团聚状态，从而通过观察液晶液滴的状态，了解温度的变化。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种温敏性生物传感器。根据本发明的实施例，该温敏性生物传感器包括：液晶分子；双亲DNA分子，所述双亲DNA分子具有疏水端和亲水端，所述疏水端与所述液晶分子相连；以及连接DNA，所述连接DNA的两端分别与所述双亲DNA分子的所述亲水端相连。

根据本发明实施例的温敏性生物传感器，连接DNA对其熔点的敏感度高，通过连接DNA的聚合和解聚可以灵敏的反映环境温度的变化，进而，发明人通过范德华力相互作用实现了双亲DNA分子的疏水端与液晶分子的结合，再利用连接DNA连接双亲DNA分子，通过控制连接DNA的聚合和解聚反映环境温度的变化，当温度升高超过预定温度，即连接DNA熔点，连接DNA会出现断裂从而导致液晶液滴从团聚状态变为分散状态，当温度低于预定温度时，液晶液滴又会从分散状态转变为团聚状态，从而通过观察液晶液滴的状态，了解温度的变化。由此，该温敏性生物传感器的灵敏性和准确性高。同时本发明所使用的是具有液晶相的液晶分子，由于液晶具有双折射现象，使得该温敏性生物传感器可使用偏光对传感结果进行观察，具有方便观察的优势。

另外，根据本发明上述实施例的温敏性生物传感器，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述液晶分子在室温下具有液晶相。由此，该液晶液滴可以在室温条件下即可进行液晶液滴的取向变化的检测，保证液晶液滴的性质状态完好。

根据本发明的实施例，所述液晶分子为选自5CB液晶分子、TL205液晶分子和E7液晶分子的至少一种。由此，液晶分子在室温下具有液晶相，并且液晶液滴数量多、均一性好。

根据本发明的实施例，所述疏水端为脂链。由此，易于连接至液晶液滴。

根据本发明的实施例，所述疏水端为烷基链。由此，易于连接至液晶液滴。

根据本发明的实施例，所述亲水端为具有相同末端的单链DNA分子。由此，便于与连接DNA结合。

根据本发明的实施例，所述连接DNA的两端与所述亲水端互补。由此，有利于连接DNA与双亲DNA分子互补结合。

根据本发明的实施例，所述温敏性生物传感器通过所述连接DNA的互补序列控制响应温度。由此，连接DNA的互补序列通过影响熔点控制响应温度。

根据本发明的实施例，所述温敏性生物传感器的响应温度为20-85℃。由此，温敏性生物传感器的灵敏度和准确度高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的温敏性生物传感器的结构示意图；

图2显示了液晶液滴的光学变化示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的温敏性生物传感器的解聚和聚合的示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的液晶液滴的显微结构示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的温敏性生物传感器的解聚和聚合的显微图像示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的连接DNA的熔点T_m曲线的示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的各阶段温敏性生物传感器的图片示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种温敏性生物传感器。参考图1，根据本发明的实施例，对该温敏性生物传感器(在本文中也简称为“传感器”)进行解释说明，该传感器包括：液晶分子100、双亲DNA分子200和连接DNA 300。其中，双亲DNA分子200具有疏水端和亲水端，疏水端与液晶分子100相连；连接DNA 300的两端分别与双亲DNA分子200的亲水端相连。

为了方便理解，下面首先对液晶液滴在环境中存在足量的双亲DNA分子及连接DNA时能够发生的对光线的折射能力的变化情况进行说明。具体地，参考图2，当液晶液滴所在的环境中存在的双亲DNA分子及连接DNA数量不足时，在显微镜的白光视野(参考图2A)以及偏光视野(参考图2B)中，液晶液滴中的液晶分子排列为双极状态(参考图2C)，其中，图2A和2B中箭头指示的是液晶液滴缺陷的部位，即2E和2F图中的小圆圈部位。而当环境中存在足量的双亲DNA分子及连接DNA时，液晶液滴中液晶分子的排列取向发生变化，从而导致液晶液滴对光线的折射能力发生变化，此时在显微镜的白光视野(参考图2D)以及偏光视野(参考图2E)中，液晶液滴中的液晶分子排列为辐射状态(参考图2F)。因此，2而当环境中具有能够与上述双亲DNA分子进行特异性结合的连接DNA时，连接DNA通过与双亲DNA分子结合而结合到该液晶液滴中，进而导致该液晶液滴中液晶分子的排列方式发生改变，对光线的折射能力改变，而这一改变可以方便地通过偏光显微镜观察出来，进而通过控制连接DNA的聚合和解聚实现对温度的响应。

进一步的，结合图3对该温敏性生物传感器对温度响应的原理进行说明，由于连接DNA对其熔点的敏感度高，通过连接DNA的聚合和解聚可以灵敏的反映环境温度的变化，进而，发明人将双亲DNA分子连接到液晶分子上，再利用连接DNA连接双亲DNA分子，通过控制连接DNA的聚合和解聚反映环境温度的变化。当温度升高超过预定温度，即连接DNA熔点，例如连接DNA熔点为80-85℃，当加热到该温度，连接DNA会出现断裂从而导致液晶液滴从团聚状态变为分散状态，当温度下降到低于预定温度时，液晶液滴又会从分散状态转变为团聚状态，从而通过观察液晶液滴的状态，了解温度的变化。

进而，该温敏性生物传感器利用连接DNA温度敏感性高，并且通过调整连接DNA的序列和长度可以调整熔点的特点，可以根据需要，调整温敏性生物传感器的反应温度，并且灵敏性和准确性高。

需要说明的是，液晶分子以及双亲DNA分子的具体类型不受特别限制，只要二者能够在上述条件下有效自组装并形成液晶液滴即可。根据本发明的实施例，液晶分子可以为在室温下具有液晶相的液晶分子。由此，含有上述液晶分子的液晶液滴对光线的折射情况在常温下即可随环境中表面活性剂(双亲分子以及能够与双亲分子特异性结合的待测物质)含量的改变而改变，从而该液晶液滴可以在不加热或者冷却处理的环境中完成对待测物的检测，便于该液晶液滴的应用。根据本发明的优选实施例，液晶分子为选自5CB液晶分子、TL205液晶分子和E7液晶分子的至少一种。其中，5CB是一种常用的向列相液晶，E7和TL205是两种可商业购买到的混合液晶，E7是由4-正庚烷-4’-氰基联苯(7CB)、4-正戊烷-4’-氰基联苯(5CB)、4-正辛氰基-4’-氰基联苯(80CB)和4-正戊基-4’-氰基三联苯(5CT)按一定比例组成的向列相液晶。TL205是一种含F的混合热致液晶。由此，液晶分子在室温下具有液晶相，并且液晶液滴数量多、均一性好。

需要说明的是，在本发明中，术语“室温”、“常温”特指不需要额外进行加热或者冷却处理的环境温度，而其具体温度范围不受特别限制。例如，“室温”、“常温”至通常情况下进行制备以及待测物检测等操作时的环境温度，具体地，可以为10～30℃。

根据本发明的实施例，双亲DNA分子的疏水端的结构不受特别的限制，只要能与液晶液滴结合即可。根据本发明的一些实施例，疏水端为脂链。脂链的疏水性强，空间位阻小，易于插入到液晶液滴的空隙内，将双亲DNA分子连接至液晶液滴。根据本发明的优选实施例，疏水端为烷基链。由此，烷基链的结构简单，易于制备，并其烷基链的疏水性好，而空间位阻更小，更易于插入到液晶液滴的空隙内，将双亲DNA分子连接至液晶液滴。

需要说明的是，在本发明中，DNA双亲分子的具体种类不受特别限制。本领域技术人员可以根据液晶分子的具体种类，以及需要检测的待测物的情况选择适当的DNA双亲分子。例如，根据本发明的具体实施例，可以选择线性液晶分子5CB作为液晶分子，选择DNA-C18、DNA-G2CL、DNA-PS或者DNA-PPO作为DNA单链双亲分子。所选择的DNA序列可以为(TGG TGA AGT AGA TGT GTA，SEQ ID NO：9)。

根据本发明的实施例，亲水端为具有相同末端的单链DNA分子。由此，单链DNA分子易于与连接DNA通过碱基互补配对结合，进而，通过连接DNA控制液晶分子的团聚和分散。

根据本发明的实施例，连接DNA的两端与亲水端互补。由此，单链DNA分子易于与连接DNA通过碱基互补配对结合，并且结合效果好，进而，通过连接DNA控制液晶分子的团聚和分散。

根据本发明的实施例，温敏性生物传感器通过连接DNA的互补序列控制响应温度。通过调节连接DNA的互补序列的长度和碱基的序列即可改变连接DNA的熔点，例如，序列的长度越长，熔点越高，而序列中G和C的含量越高，则DNA的熔点越高。

根据本发明的一些实施例，温敏性生物传感器的响应温度为20-85℃。在该温度范围内，连接DNA的熔点易于精确的控制，从而是温敏性生物传感器的灵敏度和准确度更高。

根据本发明的一些实施例，连接DNA具有如下所述核苷酸序列时，连接DNA的熔点为65℃，则温敏性生物传感器的响应温度为80-85℃。

R1：TCT ATT CGC ATG AGA ATT CCA TTC ACC GTA AG TAC ACA TCT ACTTCA CCA(SEQ ID NO：1)

R2：CTT ACG GTG AAT GGA ATT GTC ATG CGA ATA GA TAC ACA TCT ACT TCA CCA(SEQ ID NO：2)

根据本发明的一些实施例，连接DNA具有如下所述核苷酸序列时，连接DNA的熔点为50℃～55℃，则温敏性生物传感器的响应温度为50℃～55℃。

R3：TCT ATT CGC ATG AGA ATT CCA TTC ACC GTA AG TAC ACA TCT A(SEQ ID NO：3)

R4：CTT ACG GTG AAT GGA ATT GTC ATG CGA ATA GA TAC ACA TCT A(SEQ ID NO：4)

根据本发明的一些实施例，连接DNA具有如下所述核苷酸序列时，连接DNA的熔点为40℃，则温敏性生物传感器的响应温度为40℃。

R5：TCT ATT CGC ATG AGA ATT CCA TTC ACC GTA AG TAC ACA TC(SEQ ID NO：5)

R6：CTT ACG GTG AAT GGA ATT GTC ATG CGA ATA GA TAC ACA TC(SEQ ID NO：6)

根据本发明的一些实施例，连接DNA具有如下所述核苷酸序列时，连接DNA的熔点为17-23℃，则温敏性生物传感器的响应温度为17-23℃。

R7：TCT ATT CGC ATG AGA ATT CCA TTC ACC GTA AG TACGCA TC(SEQ ID NO：7)

R8：CTT ACG GTG AAT GGA ATT GTC ATG CGA ATA GA TAC GCA TC(SEQ ID NO：8)

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

采用细胞破碎仪制备液晶液滴，并组装形成温敏性生物传感器，并观察该传感器在特定温度下，利用偏光显微镜观察的光学变化。

(1)将10μL 5CB液晶液滴加入到50μL 20μM DNA双亲分子DNA-C18中,用细胞破碎仪20％功率乳化30s以制备液晶液滴。利用显微镜观察液晶液滴的形态，如图4所示，制备得到的液晶液滴数目众多，尺寸相对均一。

(2)取步骤(1)制备的10μL液晶液滴置于低吸PC管中，再加入10μL 20μM DNA linker(R₁+R₂)溶液，静置5min左右让其自主装，形成温敏性生物传感器，其中，DNA linker(R₁+R₂)具有SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列，该DNA linker的熔点T_m曲线如图6所示，熔点为65℃左右。

(3)分别取步骤(1)和(2)中的溶液，稀释50倍，通过偏光显微镜观察实验现象，如图5所示，其中，图5A为步骤(1)的液晶液滴明场图，图5B为步骤(1)的液晶液滴的偏光图，图5C为步骤(1)的液晶液滴照片，图5D为步骤(2)的聚集状态的温敏性生物传感器的明场图，图5E为步骤(2)的聚集状态的温敏性生物传感器的偏光图，图5F为步骤(2)的聚集状态的温敏性生物传感器照片。

(4)将步骤(2)得到的聚集态的温敏性生物传感器使用水浴加热到80-85℃，通过偏光显微镜观察实验现象，如图5G-I所示，其中，图5G为加热后的温敏性生物传感器恢复室温后的明场图，图5H为加热后的温敏性生物传感器恢复室温后的偏光图，图5I为加热后的温敏性生物传感器照片。

(5)当步骤(4)的温敏性生物传感器的温度恢复室温后，通过偏光显微镜观察实验现象。如图5G、5H所示，当经历了升温欲将聚集状态液晶分子分开的过程后，待溶液恢复到室温后，液晶液滴会再次发生聚集。

另外，图7示出了各阶段温敏性生物传感器的照片，结合图5和7对各阶段温敏性生物传感器的状态进一步说明，制备出的液晶液滴(图5A、5B和7A)分散均匀，加入连接DNA后，液晶液滴发生聚集(图7B，5F、5D和5E)，并沉淀下来；对液晶液滴进行加热，当加热到85℃时，液晶液滴呈现分散状态(图7C)。当温度恢复到室温后，会有部分已分散的液晶液滴再次发生聚集现象，所以在白光和偏光下会发现仍有很多聚集现象的液晶液滴(图7D、5G和5H)。

上述结果表明，当温度升高超过连接DNA熔点，本实施例中连接DNA熔点为65℃左右，连接DNA解聚的温度为80-85℃，当加热到85℃，连接DNA会出现断裂从而导致液晶液滴从团聚状态变为分散状态，当温度下降到室温时，液晶液滴又会从分散状态转变为团聚状态，从而通过观察液晶液滴的状态，了解温度的变化。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。