液晶液滴、生物传感器及检测凝血酶的方法与流程

本发明涉及材料领域，具体地，本发明涉及液晶液滴、生物传感器及检测凝血酶的方法。

背景技术：

液晶态是一种处于固态晶体和无序液体之间的“软物质态”。液晶分子具有长程有序性和光学各向异性，已被广泛应用于平面显示领域。1998年美国威斯康星大学Abbott研究组首次利用液晶分子构建生物传感器，开辟了液晶应用新领域。液晶生物传感器易于实现微型化和阵列化，具备结构简单、检测简便快速等优点，在生命科学、临床医学和食品安全领域展现了广阔的应用前景。液晶传感器的基本原理是：在检测目标化合物前后，液晶分子由于与目标化合物结合，发生取向变化，从而改变液晶分子对光线的折射能力，应用偏光显微镜检测液晶分子的折射变化可实现对待测物分子的检测。

然而，液晶生物传感器仍有待改进，液晶生物传感器的用途仍有待进一步开发。

技术实现要素：

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

目前凝血酶的检测方法例如Rayleigh光散射法，凝血酶生成动力学血凝检查法，发色底物法，荧光法等，耗时较长，且依赖于特定仪器。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出了一种能够用于快速、准确检测凝血酶的液晶液滴、生物传感器和方法，且该检测方法不依赖于特定仪器，只需肉眼观察即可判定。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种液晶液滴。根据本发明的实施例，所述液晶液滴包括：液晶分子以及双亲分子，其中，所述双亲分子包括疏水分子和凝血酶适配体，所述疏水链分子与所述凝血酶适配体的5’端相连，所述液晶分子与所述疏水分子相连。其中，所述液晶分子与所述疏水分子通过疏水作用连接，所述疏水链分子与所述凝血酶适配体的5’端通过化学键相连。利用根据本方明实施例的液晶液滴，可以通过肉眼观察实现对凝血酶的快速、灵敏、有效的检测。

根据本发明的实施例，上述液晶液滴还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述液晶分子为5CB。5CB的结构如式I所示，

液晶分子5CB在室温下具有液晶相，由此，该液晶液滴可以在不加热或者冷却处理的环境中完成对待测物的检测，从而更加便于该液晶液滴应用于对凝血酶的检测。

根据本发明的实施例，所述疏水分子包括选自C₁₈、G2CL、PS、PPO的至少之一。其中，G2CL的结构如式II所示，PS的结构如式III所示，PPO的结构如式IV所示，C₁₈的结构如式V所示，

上述疏水分子可以有效地与凝血酶适配体的5’端通过化学键相连，并通过疏水作用与液晶分子相连，进而组装形成液晶液滴。组装形成的液晶液滴在环境中存在凝血酶时，可以使该液晶液滴发生聚集，获得的液晶液滴可应用于对凝血酶的快速、灵敏、有效的检测。

根据本发明的实施例，所述凝血酶适配体具有SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列。

AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTACACATCTACTTCACCA(SEQ ID NO：1)。

TGGTTGGTGTGGTTGGTACACATCTACTTCACCA(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列与凝血酶的特异性结合能力强，进而获得的液晶液滴对于凝血酶的检测更加快速、灵敏。

根据本发明的实施例，所述液晶液滴是通过如下方式制备的：将所述液晶分子以及所述双亲分子混合以便形成混合物，采用超声波乳化处理所述混合物，所述超声波乳化处理的功率为4KH。发明人通过实验发现，通过上述方式，可以使液晶分子以及双亲分子发生更有效的组装，获得的液晶液滴数量多、均一性好，进而对该液晶液滴所在环境中的凝血酶进行更加快速、灵敏、有效的检测。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种生物传感器。根据本发明的实施例，所述生物传感器包括前面所述的液晶液滴。由此，可以对能够与液晶液滴中含有的凝血酶适配体特异性结合的凝血酶进行快速、灵敏、有效的检测。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测凝血酶的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)提供前面所述的液晶液滴；(2)将生物样品与所述液晶液滴混合；以及(3)观察所述生物样品与所述液晶液滴混合后，液晶液滴是否出现团聚现象，其中，所述生物样品与所述液晶液滴混合后，所述液晶液滴出现团聚现象是所述生物样品中具有凝血酶的标志。利用根据本发明实施例检测凝血酶的方法，可通过肉眼观察，进而快速、灵敏、有效的完成对凝血酶的检测。

根据本发明的实施例，上述检测凝血酶的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述生物样品中凝血酶的最低检测限是2mM。发明人通过实验发现，生物样品中凝血酶的浓度低于2mM，液晶液滴不发生团聚现象或团聚现象不明显，进而当生物样品中凝血酶的浓度不小于2mM时，利用根据本发明实施例的检测凝血酶的方法检测凝血酶，结果会更加准确、可靠。

根据本发明的实施例，所述液晶液滴是以第一液晶液滴和第二液晶液滴的混合物的形式提供的，其中，所述第一液晶液滴的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二液晶液滴的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。发明人发现，液晶液滴以第一液晶液滴和第二液晶液滴的混合物的形式提供，利用根据本发明实施例的检测凝血酶的方法检测凝血酶，检测的灵敏性会进一步提高。

根据本发明的实施例，所述第一液晶液滴和所述第二液晶液滴的摩尔比为1：1。发明人发现，当第一液晶液滴和第二液晶液滴的摩尔比为1：1时，利用根据本发明实施例的检测凝血酶的方法检测凝血酶，检测的灵敏性会进一步显著提高。

附图说明

图1显示了根据本发明实施例1的液晶液滴的显微镜照片；

图2显示了本发明实施例1的液晶液滴与DNA链结合的原理示意图；

图3显示了根据本发明实施例1的液晶液滴与DNA链结合前后的显微镜照片；以及图4显示了根据本发明实施例3的液晶液滴对凝血酶或非凝血酶响应的实验结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

液晶液滴

在本发明的第一方面，本发明提出了一种液晶液滴。根据本发明的实施例，该液晶液滴包括：液晶分子以及双亲分子，其中，所述双亲分子包括疏水分子和凝血酶适配体，所述疏水链分子与所述凝血酶适配体的5’端相连，所述液晶分子与所述疏水分子相连。其中，所述液晶分子与所述疏水分子通过疏水作用连接，所述疏水链分子与所述凝血酶适配体的5’端通过化学键相连。利用根据本方明实施例的液晶液滴，可以通过肉眼观察实现对凝血酶的快速、灵敏、有效的检测。

需要说明的是，上述液滴中选用的液晶分子以及双亲分子中的疏水链分子的具体类型不受特别限制，只要能够有效自组装并形成液晶液滴即可。例如，根据本发明的实施例，液晶分子可以为在室温下具有液晶相的液晶分子5CB。5CB的结构如式I所示，

液晶分子5CB在室温下具有液晶相，由此，该液晶液滴可以在不加热或者冷却处理的环境中完成对待测物的检测，从而更加便于该液晶液滴应用于对凝血酶的检测。需要说明的是，在本发明中，术语“室温”、“常温”特指不需要额外进行加热或者冷却处理的环境温度，而其具体温度范围不受特别限制。例如，“室温”、“常温”至通常情况下进行制备以及待测物检测等操作时的环境温度，具体地，可以为10～30摄氏度。

再例如，根据本发明的实施例，所述疏水分子包括选自C18、G2CL、PS、PPO的至少之一。其中，G2CL的结构如式II所示，PS的结构如式III所示，PPO的结构如式IV所示，C18的结构如式V所示。上述疏水分子可以有效地与凝血酶适配体的5’端通过化学键相连，并通过疏水作用与液晶分子相连，进而组装形成液晶液滴。组装形成的液晶液滴在环境中存在凝血酶时，可以使该液晶液滴发生聚集，获得的液晶液滴可应用于对凝血酶的快速、灵敏、有效的检测。

另外，根据本发明的具体实施例，所述凝血酶适配体具有SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列。发明人发现，SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列与凝血酶的特异性结合能力强，进而获得的液晶液滴对于凝血酶的检测更加快速、灵敏。

根据本发明的实施例，上述液晶液滴是通过如下方式制备的：将所述液晶分子以及所述双亲分子混合以便形成混合物，采用超声波乳化处理所述混合物，所述超声波乳化处理的功率为4KH。发明人通过实验发现，通过上述方式，可以使液晶分子以及双亲分子发生更有效的组装，获得的液晶液滴数量多、均一性好，进而对该液晶液滴所在环境中的凝血酶进行更加快速、灵敏、有效的检测。

生物传感器

在本发明的第二方面，本发明提出了一种生物传感器。根据本发明的实施例，所述生物传感器包括前面所述的液晶液滴。由此，该生物传感器具有利用前面描述的液晶液滴的全部特征以及优点，在此不再赘述。总的来说，该生物传感器可以对能够与液晶液滴中含有的凝血酶适配体特异性结合的凝血酶进行快速、灵敏、有效的检测。本领域技术人员能够理解的是，上述生物传感器中还可以含有能够实现传感功能的其余必须组份，本领域技术人员可以根据需要检测的具体物质，对上述必须组份进行选择。

检测凝血酶的方法

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测凝血酶的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)提供前面所述的液晶液滴

关于该液晶液滴的具体特征以及优点，前面已经进行了详细的描述，在此不再赘述。另外，根据本发明的具体实施例，发明人采用的液晶液滴中包含两种液晶液滴，一种液晶液滴中包含的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一种液晶液滴中包含的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，这两种液晶液滴的摩尔比为1：1。两种液滴分别使用SEQ：1和SEQ：2所示的核苷酸序列对其进行修饰，在使用前通过1：1的混合配置成检测用液晶液滴，这样可以避免不同液晶液滴上的DNA进行链交换，同时也降低了体系的复杂性，使得检测的结果更加简洁直观。

(2)将生物样品与所述液晶液滴混合

根据本发明的实施例，在该步骤中，将生物样品与液晶液滴混合。使生物样品中的凝血酶与液晶液滴中的双亲分子特异性结合，进而使得液晶液滴发生团聚。

(3)观察所述生物样品与所述液晶液滴混合后，液晶液滴是否出现团聚现象，其中，所述生物样品与所述液晶液滴混合后，所述液晶液滴出现团聚现象是所述生物样品中具有凝血酶的标志。

发明人通过实验发现，当生物样品中凝血酶的浓度低于2mM时，液晶液滴不发生团聚现象或团聚现象不明显，而当生物样品中凝血酶的浓度不小于2mM时，液晶液滴发生团聚现象或团聚现象显著，仅可通过肉眼直观地观察到。当生物样品中凝血酶的浓度不小于2mM时，利用根据本发明实施例的检测凝血酶的方法检测凝血酶，结果会更加准确、可靠。

综上，利用根据本发明实施例检测凝血酶的方法，可通过肉眼观察，进而快速、灵敏、有效的完成对凝血酶的检测。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特殊说明，则未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1液晶液滴的制备

将10μL 5CB加入到50μL 20μM凝血酶适配体DNA双亲分子DNA-C18中，用细胞破碎仪20％功率乳化30s以制备液晶液滴。参考图1，制备得到的液晶液滴数目众多，尺寸相对均一。

为了验证双亲分子DNA-C18成功地与液晶分子5CB发生了组装，在上述液晶液滴的环境中加入能够与DNA-C18配对的DNA链。如DNA-C18成功地与液晶分子5CB发生了组装，则在环境中存在能够与DNA-C18配对的DNA链时，上述DNA链能够通过DNA-C18使多个液晶分子之间发生团聚结合。基本原理如图2所示：实施例1中制备的液晶液滴含有液晶分子(LC)以及凝血酶适配体DNA-C18(具有3’端以及5’端，其中5’端与LC相连)，R1端以及R2端分别可以与一个凝血酶适配体DNA-C18互补配对。由此，如实施例1中制备的液晶液滴中，液晶分子与DNA-C18发生了有效的组装，则在具有R1+R2结构的DNA存在的调节下，上述液晶液滴将发生团聚。

具体操作如下：

1、取10μL实施例1中制备的液晶液滴置于低吸PC管中，再加入10μL 20μM的DNA(R1+R2)溶液，静置5min左右让其自主装。

2、分别取实施例1制备的液晶液滴以及上述含有DNA(R1+R2)溶液的溶液，各稀释50倍，通过偏光显微镜观察实验现象，实验结果如图3所示。其中，图3a以及图3b为实施例1中制备的液晶液滴的白光显微镜像以及偏光显微镜像；图3c以及图3d为加入DNA(R1+R2)的液晶液滴的白光显微镜像以及偏光显微镜像。不难看出，液晶液滴出现了明显的团聚现象。说明凝血酶适配体DNA-双亲分子组装在了液晶液滴上，使液晶液滴上的凝血酶适配体DNA-双亲分子之间互补配对，故此使液晶液滴出现了大量团聚现象，从而证明了凝血酶适配体DNA-双亲分子自组装在了液晶液滴上。

实施例2对凝血酶的响应性实验

在成功制备了凝血酶适配体DNA-液晶组装体之后，发明人利用该液晶液滴观察其对凝血酶的响应。

具体操作过程如下所述：

取10μL上述液晶液滴(其中，液晶液滴中包含两种液晶液滴，一种液晶液滴中包含的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一种液晶液滴中包含的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，这两种液晶液滴的摩尔比为1：1)置于低吸PC管中，所制备液晶液滴如图1所示，再加入1μM凝血酶溶液，静置5min左右，观察其现象。

发明人发现，在存在凝血酶的状态下，液晶液滴出现了团聚的现象，如图3c所示，而在不存在凝血酶时，液晶液滴则有良好的分散性。发明人发现这是一种简便的可以直接使用肉眼观察的检测凝血酶的方法。

实施例3对非凝血酶物质的响应性实验

更进一步地，发明人进一步检测了实施例1所获得的液晶液滴对非凝血酶物质，如腺苷、ATP的响应。

具体操作过程如下所述：

取10μL上述液晶液滴(其中，液晶液滴中包含两种液晶液滴，一种液晶液滴中包含的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一种液晶液滴中包含的凝血酶适配体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，这两种液晶液滴的摩尔比为1：1)置于低吸PC管中，平行设置5组实验，之后分别加入10μL的10mM凝血酶、腺苷、ATP，静置5min左右，观察其现象。

发明人发现，在存在凝血酶的状态下，液晶液滴出现了团聚的现象，而在其他4组平行实验中时，在存在腺苷(adenosine)、ATP的状态下，液晶液滴仍然有良好的分散性，不出现团聚的现象，结果如图4所示。进而实施例2所发现的检测凝血酶的方法具有很强的专属性。

实施例4

另外，发明人进而比较了将凝血酶适配体做成DNA探针，进而检测凝血酶，发明人发现，与利用实施例1所制备的液晶液滴检测凝血酶相比，将凝血酶适配体做成DNA探针进而检测凝血酶，检测需要借助凝胶电泳、紫外分光光度检测等技术手段判定凝血酶的有无，检测过程相对复杂，而利用实施例1所制备的液晶液滴检测凝血酶会更加简便、快速、直观，不需要借助任何仪器，仅通过肉眼观测液晶液滴的聚集与否即可判断生物样品中是否具有凝血酶。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。