一种用于检测人血清中AGEs含量的方法与流程

本发明属于疾病的诊断或检测技术领域，具体涉及一种胶乳免疫比浊法用来检测人血清中AGEs的含量。

背景技术：

AGEs是外源性或内源性的蛋白质、脂肪及核酸的氨基和还原糖发生非酶催化反应产生稳定的、不可逆的化合物，同时它能够和人体的组织和细胞相结合并造成严重的破坏。由于它的积聚会引发糖尿病等各种并发症，如糖尿病肾病、阿尔兹海默症、动脉粥样硬化、白内障等症，影响全身各系统，因此对其进行快捷、简单并准确的检验在临床诊断中具有重要意义。目前它的检测方法有放射受体分析法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法等，但是这些方法操作过程繁琐，误差大，消耗时间长，自动化程度低，线性范围窄，费用高，灵敏度低，对于临床非常不利，一般只用来定性检测。

流行病学和临床研究表明，AGEs与多种疾病的密切相关，现今对其治病机制研究已经取得了很大的进展，同时相关靶点的药物也在不断开发，所以对其进行精确的诊断和准确定量成为了关键解决的限速步骤。因此开发检测该物质的其他方法，在该临床诊断中是具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测AGEs含量的方法。采用胶乳免疫比浊法检测血清中AGEs的含量，包括游离态的AGEs和结合态的AGEs，线性范围宽好，灵敏度高，特异性好、操作简单、方便快速等优点。它能够作为一项新的临床指标，AGEs检测对阐明这些疾病的发病机制和判定治疗效果有一定价值。

本发明采用以下步骤：

一种AGEs检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

试剂R1中含有

试剂R2中含有

本发明中抗人AGEs抗体的胶乳微球的制备步骤：

1、每ml反应混合物加入下列各物：

a.去离子水是最后容积为1.0mL；

b.0.1mL的5x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-7.0(一般可用0.5M MES缓冲溶液)；胶乳微球最终浓度为5％(W/V)；

c.按照二者呈现的0.2∶1～0.5∶1的比例范围加入50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液和19.2mg/mL的EDAC在去离子水中的溶液中；

2、在室温将此混合物反应18min，不断搅拌；

3、用上述的MES缓冲液，除去未反应的NHS和EDAC；

4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为5％(w/v)；

5、将结合的蛋白质溶于MES缓冲溶液中，浓度为1mg/mL；

6、立即加入蛋白质溶液；

7、将混合物反应至少2h，轻轻搅拌；

8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；

9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液中。

本发明的优点：

1.采用的不同粒径的胶乳微球，提升了检测的线性范围和灵敏度。

2.采用的偶联剂NHS和EDAC的加入比例的多少，提升了抗体与微球的偶联效率。

3.试剂的线性范围宽，准确度高，使用方便，满足临床需要。

附图说明：

图1：实施例1与对比方法相关性图

图2：实施例2与对比方法相关性图

图3：实施例3与对比方法相关性图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

按照下面讲述的检测步骤，在550nm的波长下，试剂R1∶试剂R2＝4∶1，偶联剂NHS和EDAC的加入比例0.5∶1，检测一批数量为40例血清样本。

本实施例描述的AGEs检测方法，使用双试剂全自动生化分析仪，例如贝克曼DXC800、日立7600等全自动分析仪，选用终点法进行测定。将R1和R2放置所设置好的位置上，在样本盘中对应位置放好蒸馏水、标准品和待测样本，操作如下：

表1操作程序

结果计算：以测定管ΔA，根据校准曲线可求得AGEs含量。

实施例2

按照下面讲述的检测步骤，在600nm的波长下，试剂R1∶试剂R2＝5∶1，偶联剂NHS和EDAC的加入比例0.2∶1，检测同实施例1相同的40例血清样本。

本实施例描述的AGEs检测方法，使用双试剂全自动生化分析仪，例如贝克曼DXC800、日立7600等全自动分析仪，选用终点法进行测定。将R1和R2放置所设置好的位置上，在样本盘中对应位置放好蒸馏水、标准品和待测样本，操作如下：

表2操作程序

结果计算：以测定管ΔA，根据校准曲线可求得AGEs含量。

实施例3

按照下面讲述的检测步骤，按照上述的检测步骤，在580nm的波长下，试剂R1∶试剂R2＝6∶1，偶联剂NHS和EDAC的加入比例0.4∶1，检测同实施例1和实施例2相同的40例血清例样本。

本实施例描述的AGEs检测方法，使用双试剂全自动生化分析仪，例如贝克曼DXC800、日立7600等全自动分析仪，选用终点法进行测定。将R1和R2放置所设置好的位置上，在样本盘中对应位置放好蒸馏水、标准品和待测样本，操作如下：

表3操作程序

结果计算：以测定管ΔA，根据校准曲线可求得AGEs含量。

实施例4

将上述实施例1～3的相同血清样本进行荧光光谱法检测(对比方法)，实施例1～3的结果与对比方法比较。

表4所有实施例检测结果汇总(ng/mL)

综合上述结果实施例1～3中的结果采用BS-420全自动生化分析仪，对40个血清样本进行测定，并对测定值进行相关分析并与对比方法检测结果比较，其中实施例1的相关系数：r²＝0.997，线性方程为：y＝0.999x+0.067。其中实施例2的相关系数：r²＝0.982，线性方程为：y＝1.003x+0.124。其中实施例3的相关系数：r²＝0.964，线性方程为：y＝0.960x+0.469；结果表明实施例1中的试剂的检测与对比方法的相关性较好。