本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针EPO4的促红细胞生成素试剂盒及其检测方法。
背景技术：
EPO是促红细胞生成素（ErythropoietEP）的英文简称。人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比）。这种药物近年进入商业市场。人体缺氧时，此种激素生成增加，并导致红细胞增生。EPO兴奋剂正是根据促红细胞生成素的原理人工合成，它能促进肌肉中氧气生成，从而使肌肉更有劲、工作时间更长。
促红细胞生成素是对红细胞的生成有增强作用的体液性因子。为分子量6-7万的糖蛋白，糖的含量多，已证明血和尿中都有它的存在。未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞（erythropoietin responsive cell），促红细胞生成素在此发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时，根据身体组织对氧的需要，促红细胞生成素的供给量将增加，但在肾脏贫血时其含量则非常低。其生成器官和机制虽尚未清楚，可是作为某肾脏因子（renal erythropoietic factor）与血浆的基质反应产生肾小球的说法是有力的。此外，起着相当于促红细胞生成素作用的因子中，促进白细胞生成的有colony stimulating factor，促进血小板生成的为促血小板生成素，包括促红细胞生成素在内，统称为造血促进因子。
增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。用于治疗慢性肾衰患者的贫血症。治疗最初1～3周观察到血细胞比容增加，且与剂量成比例，在4～6周中血细胞比容水平在不同研究中可达30%～40%之间不等，患者的生活质量提高，包括体力耐受、情绪、起居方式和性功能的提高。对慢性肾衰不需要透析的贫血患者的研究表明，使用本品也是有利的。
目前促红细胞生成素的检测方法有三大类：色谱法、免疫学法、循环酶法。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化；而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。免疫学法需要还原游离EPO形式，抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测游离型同型半胱胺酸，只能检测血浆总糖化蛋白，用还原剂在37℃半小时卵育对血样进行还原处理。免疫学法需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐，因为需要进行还原处理可受一些不确定的因素影响。循环酶法过程繁琐，且检测限低、产生误差较大，价格昂贵，故得不到推广。
核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子, 国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成) 文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~ 60 个核苷酸。
由上可知，核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性, 使其在疾病诊断中具有良好的应用前景, 尽管目前成熟的临床应用报道较少, 但应用适体检测球蛋白的研究却不断增多, 基于适体的检测新技术也不断出现。但是目前基于核酸适体的针对于促红细胞生成素的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于促红细胞生成素的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素EPO试剂盒及其检测方法。
本发明的方案是通过这样实现的：
一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；促红细胞生成素标准品；促红细胞生成素核酸适体荧光探针；所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：agagggttgc agtcctagat gccggattta tcactacg。 该序列命名为EPO4。
以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl2。
以上任一所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液、促红细胞生成素标准品、促红细胞生成素核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。
以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的促红细胞生成素浓度。
一种用以上任一所述基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：
（1）血样裂解：将血样和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混匀，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液；
（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步骤1）得到的上清液和30~50ul的用含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液，溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5~15min，使促红细胞生成素核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
以上所述的生物医学软件为Sigma plot软件，于市面上可以购买到。
以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂中促红细胞生成素核酸适体荧光探针浓度为200~400 nmol/L，其特性还在于,所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：agagggttgc agtcctagat gccggattta tcactacg。
促红细胞生成素核酸适体荧光探针不与促红细胞生成素结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离, 荧光激发后发射波长在 370~ 400nm 之间；促红细胞生成素核酸适体荧光探针与促红细胞生成素结合时，促红细胞生成素诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在 480 到 500nm之间。
以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl2；所述荧光检测仪为具有时间分辨荧光测定的荧光检测仪。
以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的促红细胞生成素浓度。
本发明的原理是：在不与促红细胞生成素时，核酸适体处于比较松散的结构，5' 和3' 两端的芘分子单体相互游离, 荧光发射波长在 370 到 400nm 之间；与促红细胞生成素结合时，促红细胞生成素诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5' 和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成二聚体，芘激发态发射波长二聚体在 480 到 500nm之间。芘激发态二聚体荧光寿命有着长达100 ns，比生物样品自发荧光寿命（约为5 ns）长，通过检测促红细胞生成素核酸适体探针和样品混合后的荧光强度和荧光寿命，计算样品中促红细胞生成素的浓度。
本发明的实质性特点和显著进步是：
（1）检测操作简单快速，无需复杂样品加工和分离，将核酸适体探针直接加入裂解后的血样液，用荧光分光光度计短时间内就可以检测480~500nm处的荧光值；
（2）本试剂盒及其检测方法具有灵敏度高，检测结果重复性高，样品检测误差在0.01~0.1%之间，特异性强，促红细胞生成素核酸适体荧光探针不与促红细胞生成素结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离, 荧光激发后发射波长在 370~ 400nm 之间；其与促红细胞生成素结合时，促红细胞生成素诱导其发生改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成二聚体，荧光激发后二聚体发射波长在 480~ 500nm之间。
（3）所用的试剂可以使配制好可直接使用的液体试剂或是使用前加水溶解后使用的干粉状态，检测试剂可以常温贮存，运输方便。
具体实施方式
以下结合表1和实施例描述本发明基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素EPO试剂盒及其检测方法。
表1.实施例中的试剂盒试剂成分组成
实施例1
按照表1中实施例1所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置30min，再中速离心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取20μl步骤1）得到的上清和45ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.15±0.01%。
实施例2
按照表1中实施例2所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:2.5混匀，静置5min，再中速离心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步骤1）得到的上清和30ul的
用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育6min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。样品的3个平行测定误差为0.02±0.01%。
实施例3
按照表1中实施例3所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:3.5混匀，静置10min，再中速离心5min，收集上清；
（2）混合卵育：取75μl步骤1）得到的上清和45ul的
用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育7min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.04±0.01%。
实施例4
按照表1中实施例4所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置25min，再中速离心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取100μl步骤1）得到的上清和50ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育8min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.05±0.01%。
实施例5
按照表1中实施例5所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:1.0混匀，静置20min，再中速离心9min，收集上清；
（2）混合卵育：取80μl步骤1）得到的上清和30ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育9min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.03±0.01%。
实施例6
按照表1中实施例6所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:4.5混匀，静置15min，再中速离心10min，收集上清；
（2）混合卵育：取30μl步骤1）得到的上清和40ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育10min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.08±0.01%。
实施例7
按照表1中实施例7所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:3.0混匀，静置18min，再中速离心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步骤1）得到的上清和20ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育12min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.1±0.01%。
实施例8
按照表1中实施例8所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:2.0混匀，静置26min，再中速离心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取60μl步骤1）得到的上清和25ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育13min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.02±0.01%。
实施例9
按照表1中实施例9所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:4.0混匀，静置8min，再中速离心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取40μl步骤1）得到的上清和35ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育15min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.01±0.01%。
序列表
<110> 柳州立洁科技有限公司
<120> 基于高亲和力兴奋剂核酸适体EPO4促红细胞生成素兴奋剂试剂盒及其检测方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagggttgc agtcctagat gccggattta tcactacg 38