一种pH不敏感荧光蛋白标记的生物组织的荧光控制方法与流程

本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种pH不敏感荧光蛋白标记的生物组织的荧光控制方法。

背景技术：

在生物组织中详细地获取分子和蛋白的空间分布，可以更加清楚地了解生物学信号的传导通路，解析生物功能的形成，是理解生物体结构和功能关系的重要基础。荧光蛋白标记技术作为一种有用的基因标记手段，能够在活体状态下，针对感兴趣的细胞和亚细胞结构进行标记，同时，为了更好的研究这些细胞和亚细胞结构的相互关系，在同一生物体内进行多种荧光蛋白共标记的方法，已被广泛应用于生物学及医学领域。

针对厚组织进行光学成像时，目前已有的层析技术主要有两种：一种是光学层析技术，通过光学方法抑制焦面以外的荧光从而提高z向分辨率。光学层析技术的主要限制在于其z向分辨率只能够达到500nm，并且较低的z向分辨率极大地限制了多色荧光蛋白标记的生物组织亚细胞结构成像的需求；另一种是物理层析技术，通过将生物组织包埋在树脂中，通过物理切片的方式产生组织薄片，再对组织薄片进行宽场成像，物理层析技术的主要限制在于通过这种方法进行成像的过程中，组织薄片容易丢失，操做复杂，得到的图像，其后期处理及三维配准非常困难，无法用于大体积的生物组织。

pH不敏感的荧光蛋白，如红色荧光蛋白DsRed用于标记生物组织时，由于没有合适的荧光控制方法，成像时只能采用物理层析进行大体积成像，例如采用双光子显微镜进行点扫描，成像速度很慢，而且存在背景荧光干扰、轴向分辨率低的问题。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光控制方法，其目的在于利用过渡金属离子和氢离子的协同作用将红色荧光蛋白标记的生物组织荧光蛋白淬灭，利用金属离子螯合剂和氢氧根离子的协同作用将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，实现DsRed标记的生物组织的荧光控制，由此解决现有技术的pH不敏感的荧光蛋白标记生物组织由于荧光不能控制或缺乏合适的荧光控制方法而导致的进行荧光成像时的背景荧光干扰、轴向分辨率低、成像速度慢的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种红色荧光蛋白DsRed标记生物组织的荧光控制方法，包括如下步骤：

(1)荧光淬灭：采用淬灭化学试剂将红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光淬灭，得到荧光淬灭的生物组织，所述淬灭化学试剂包括过渡态金属离子，所述淬灭化学试剂的pH为3～6；

(2)荧光重激活：采用重激活化学试剂将步骤(1)所述的荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，所述重激活化学试剂包括金属离子螯合剂，所述重激活化学试剂的pH为10～13。

优选地，所述淬灭化学试剂的pH为3～5。

优选地，所述淬灭化学试剂为过渡态金属离子化合物的水溶液。

优选地，所述淬灭化学试剂为过渡态金属离子化合物的水溶液和酸的混合溶液。

优选地，所述酸为醋酸。

优选地，所述过渡态金属离子为Cr²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺和/或Cu²⁺中的一种或多种。

优选地，所述过渡态金属离子为Cu²⁺。

优选地，所述过渡态金属离子的浓度为10mM至500mM。

优选地，所述过渡态金属离子的浓度为100mM。

优选地，所述重激活化学试剂的pH为11～12。

优选地，所述重激活化学试剂为金属离子螯合剂。

优选地，所述重激活化学试剂为金属离子螯合剂与碱的混合溶液。

优选地，所述碱为碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。

优选地，所述金属离子螯合剂为EDTA-Na₄、EDTA-Na₃和/或二乙二胺中的一种或多种。

优选地，所述金属离子螯合剂为EDTA-Na₄。

优选地，所述重激活化学试剂为原卟啉钠和碱的混合溶液。

优选地，所述金属离子螯合剂的浓度为100mM至500mM。

优选地，所述金属离子螯合剂的浓度为200mM。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

(1)本发明利用过渡金属离子和氢离子的协同作用将红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织荧光蛋白淬灭，利用金属离子螯合剂和氢氧根离子的协同作用将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，实现DsRed标记的生物组织的荧光的精确控制，淬灭彻底完全，激活方便，效果好，其荧光强度对比度大大增加，其重新激活后的荧光强度是淬灭状态的荧光强度的20倍以上，保证了其用于进一步成像的成像效果；

(2)本发明pH不敏感的红色荧光蛋白DsRed标记生物组织的荧光控制方法可以应用于生物组织的层析成像，由于荧光淬灭完全，因此成像时，不存在背景荧光干扰的问题；

(3)本发明的荧光控制方法应用于DsRed标记的生物组织的层析成像时，重激活荧光可以只激活生物组织样品表层被淬灭的荧光，这样激活表层的厚度即为层析成像时的轴向分辨率，从而能够稳定地实现微米或纳米级层析厚度；

(4)本发明的红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光控制方法，结合宽场成像系统能够对红色荧光标记的样品同时进行化学层析成像，实现大体积生物组织的快速成像；pH不敏感的DsRed红色荧光蛋白，在过渡态金属离子的作用下使DsRed红色荧光蛋白产生pH值敏感性，可以兼容pH敏感的荧光蛋白实现多色标记成像，实现鼠脑神经结构研究的双通道标记和大样本轴向高分辨成像；

(5)本发明的荧光控制方法简单易行，采用的化学试剂价廉易得。

附图说明

图1是本发明的红色荧光蛋白DsRed标记生物组织的荧光控制方法流程图；

图2是本发明的红色荧光蛋白DsRed的淬灭-重激活机理；

图3是不同浓度的CuSO₄水溶液的PH值；

图4是不同浓度的EDTA-Na₄水溶液的PH值；

图5是实施例1的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图5(a)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片在100mM CuSO₄溶液中淬灭30分钟后的图像，其为对比度增大20倍处理后的图像；图5(b)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片浸渍在200mM EDTA-Na₄溶液中重激活的图像。

图6是实施例2的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图6(a)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片在200mM FeCl₃溶液中淬灭30分钟后的图像，其为对比度增大10倍处理后的图像；图6(b)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片浸渍在400mM原卜啉钠溶液并采用氢氧化钠将pH值调节至11～12后重激活的图像。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的一种红色荧光蛋白DsRed标记生物组织的荧光控制方法，包括如下步骤：

(1)荧光淬灭：采用淬灭化学试剂将红色荧光蛋白标记的生物组织的荧光淬灭，得到荧光淬灭的生物组织，所述淬灭化学试剂包括过渡态金属离子，所述淬灭化学试剂的pH为3～6,优选为3～5。

其中，所述淬灭化学试剂可以为水解呈酸性的过渡态金属离子溶液；也可以为过渡态金属离子溶液和酸的混合溶液，其pH均为为3～6，优选为3～5，其中酸优选为弱酸，如醋酸。太强的酸会导致淬灭不可逆，不能重激活，因此淬灭化学世界的pH控制很重要。

过渡态金属离子为Cr²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺和/或Cu²⁺中的一种或多种，优选为Cu²⁺。所述的二价铜离子(Cu²⁺)的离子化合物为CuSO₄、CuCl₂、Cu(NO₃)₂、Cu(CH₃COO)₂等试剂。更优选的，所述的二价铜离子(Cu²⁺)的离子化合物为CuSO₄水溶液。

过渡态金属离子的浓度为10mM至500mM，优选为100mM。

(2)荧光重激活：采用重激活化学试剂将步骤(1)所述的荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，所述重激活化学试剂包括金属离子螯合剂，所述重激活化学试剂的pH为10～13，优选为11～12。

重激活化学试剂可以为水解呈碱性的金属离子螯合剂，其pH为10～13，优选为11～12；重激活化学试剂也可以为金属离子螯合剂与碱的混合溶液，其pH为10～13，优选为11～12，其中碱优选为碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。

能水解呈碱性的金属离子螯合剂为EDTA-Na₄、EDTA-Na₃和/或二乙二胺中的一种或多种，优选为EDTA-Na₄。

重激活化学试剂也可为原卟啉钠和碱的混合溶液，其pH为10～13，优选为11～12。

金属离子螯合剂的浓度为100mM至500mM，优选为200mM。

本发明的红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织首先织采用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理，然后再使用本发明的荧光控制方法进行荧光的淬灭和重激活。图1为本发明的红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光控制方法的流程图。

本发明提供的红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光控制方法，利用过渡金属离子和氢离子的协同作用将红色荧光蛋白标记的生物组织荧光蛋白淬灭，利用金属离子螯合剂和氢氧根离子的协同作用将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，实现DsRed标记的生物组织的荧光的精确控制，淬灭彻底完全，重激活荧光程度高，试剂便宜易得且操作简单。红色荧光蛋白DsRed来源于红珊瑚，对pH值不敏感，本发明采用过渡态金属离子作用于红色荧光蛋白DsRed，使之产生pH敏感性。

图2为本发明的荧光控制方法对红色荧光蛋白DsRed标记生物组织时的荧光的淬灭-重激活机理示意图，过渡金属离子如二价铜离子的水溶液由于水解产生弱酸性，如图3所示，图3为不同铜离子浓度对应的PH值，因此二价铜离子的水溶液中具有氢离子，铜离子与DsRed荧光蛋白发色团周围的蛋白质结合，使得氢离子可以和DsRed荧光蛋白分子结合形成氢键，降低DsRed荧光发色团的共轭π电子云的密度，达到淬灭荧光的效果。但是DsRed本身不是pH敏感的荧光蛋白，不会由于氢离子的存在而淬灭。本发明的申请人发现在有过渡金属离子的存在下，由于氢离子和过渡金属离子的协同作用，才使得DsRed荧光蛋白分子发生淬灭。

荧光重激活的过程是荧光淬灭的逆过程。图4为不同浓度的EDTA-Na₄水溶液与pH值的对应关系，可以看出其水解呈碱性，pH为10～12，EDTA-Na₄溶液水解后产生氢氧根离子。采用金属离子的螯合剂，尤其是水解呈碱性的金属离子螯合剂，通过螯合剂和氢氧根离子的协同作用，从而实现荧光蛋白分子标记生物组织的荧光的重激活。直接用氢氧根离子也可以重激活被淬灭的荧光，但是效果不如加入金属离子螯合剂，即不如利用氢氧根离子和螯合剂的协同效果好。

本发明的红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光控制方法荧光淬灭效果好，重激活荧光强度高，对比度高，可以结合宽场成像系统对红色荧光蛋白标记的生物组织样品进行化学层析成像，实现大体积生物组织的多色快速成像。首先采用本发明的荧光淬灭化学试剂将生物组织的荧光信号全部进行可逆的淬灭，然后在成像过程中通过激活化学试剂将表面的荧光信号进行重新激活。用光化学层析技术结合宽场显微成像方法，在成像过程中通过用荧光激活化学试剂激活被包埋组织的表层，表层激活厚度即为z向层析厚度，能够稳定地实现微米或纳米级层析厚度，z向的层析不依赖于光学系统，能够对多色荧光蛋白标记的生物组织进行z轴向高分辨率成像；由于荧光淬灭完全，因此成像时，该荧光控制方法能够抑制照明光对下层荧光蛋白的激发，不存在背景荧光干扰的问题。

以下为实施例：

实施例1

(1)将红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用100mM的CuSO₄溶液(pH为4～5)进行淬灭处理30分钟并进行荧光成像；

(3)将猝灭后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用200mM的EDTA-Na₄水溶液(pH为11～11.5)进行重激活30分钟同时进行荧光成像。

图5是本实施例的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图5(a)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片在100mM CuSO₄溶液中淬灭30分钟后的图像，其对比度进行了增大20倍的处理，以便于和重激活后的荧光强度进行比较；图5(b)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片浸渍在200mM EDTA-Na₄溶液中重激活的图像。

可以看出，重激活后的鼠脑荧光强度与淬灭后的鼠脑图像对比度增大20倍的荧光强度相当，说明采用本实施例的荧光淬灭-重激活控制方法，可以将鼠脑组织的荧光对比度增大20倍或更高。

实施例2

(1)将红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用200mM的FeCl₃溶液(pH为3.5～4.5)进行淬灭处理30分钟并进行荧光成像；

(3)将猝灭后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用400mM的原卟啉钠水溶液并采用氢氧化钠将pH调节至11～12后进行重激活30分钟同时进行荧光成像。

图6是实施例2的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图6(a)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片在200mM FeCl₃溶液中淬灭30分钟后的图像，其对比度进行了增大10倍的处理，便于和重激活后的鼠脑组织的荧光强度进行比对；图6(b)是红色荧光蛋白DsRed标记鼠脑片浸渍在400mM原卟啉钠溶液并采用氢氧化钠将pH值调节至11～12后重激活的图像。

可以看出，重激活后的鼠脑组织的荧光强度与淬灭后的鼠脑图像对比度增大10倍的荧光强度相当，说明采用本实施例的荧光淬灭-重激活控制方法，可以将鼠脑组织的荧光对比度增大10倍或更高。

实施例3

(1)将红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用10mM的CoSO₄溶液及醋酸将溶液的pH调至3～4，进行淬灭处理30分钟并进行荧光成像；

(3)将猝灭后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用100mM的EDTA-Na₃水溶液(pH为11～11.4)进行重激活30分钟同时进行荧光成像。

重激活后的鼠脑组织的荧光强度与淬灭后的鼠脑图像对比度增大10倍的荧光强度相当，说明采用本实施例的荧光淬灭-重激活控制方法，可以将鼠脑组织的荧光对比度增大10倍或更高。

实施例4

(1)将红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用500mM的FeCl₂溶液(pH为3.0～4.1)进行淬灭处理30分钟并进行荧光成像；

(3)将猝灭后的红色荧光蛋白DsRed标记的鼠脑中的荧光蛋白采用500mM的二乙二胺水溶液(pH为11～12)进行重激活30分钟同时进行荧光成像。

重激活后的鼠脑组织的荧光强度与淬灭后的鼠脑图像对比度增大10倍的荧光强度相当，说明采用本实施例的荧光淬灭-重激活控制方法，可以将鼠脑组织的荧光对比度增大10倍或更高。

按以下方法将实施例进行了各项性能的测试：

pH值测试：

根据GB6920-86玻璃电极法测试。样品：不同梯度浓度的待测溶液。仪器：美国奥豪斯PH计。

荧光强度测试：

样品：100微米鼠脑冠状面脑片。仪器：德国Zeiss双飞秒激光器多光子显微镜。DsRed测试条件：Laser 561nm,10％；pinhole 40；gain master 600；像素1024×1024，16bit；成像深度60微米，×20W。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。