一种定量测定培养液中油的方法与流程

本发明属于发酵
技术领域：
，更具体地，本发明涉及在发酵工程下游微生物发酵检测中利用低场核磁共振技术定量检测发酵液中油脂的方法。
背景技术：
：在抗生素发酵工业生产中，以油为碳源时由于不易发生降解物阻遏作用而有利于合成代谢产物，由于表面张力低不易产生气泡而提高了发酵罐的利用率；同时，还有强化氧传递、产物萃取剂、底物增溶剂、代谢激活剂等作用。目前，油在抗生素发酵工业中的作用还是不可替代的。为了提高发酵效率，需要对油进行定量检测，有效控制发酵过程的进行。但是，现在油脂的定量检测方法在指导发酵调控的过程中还有很多不足。索氏提取法等传统的萃取技术虽是经典方法，但是有操作繁琐，过程复杂，费时费力等缺点；尼罗红(nilered)等染料染色利用分光光度计检测油脂的方法，由于染料本身特性及局限性，具有操作计算复杂、不安全、误差较大等缺点；色谱质谱联用(gc-ms)法等为代表的色谱技术虽然有较高的准确性，但是对样品处理要求很高，检测样品时金钱和时间花费较大；近红外光谱法在油脂常规分析发展中起着重要的作用，但局限性也是多方面的，虽然其灵敏度差、扫描时间长、样品需要专门处理等得到一定的改观，但是在工业生产上还有一定的不足。低场核磁共振(low-fieldnuclearmagneticresonance，lf-nmr)一般指恒定磁场强度低于0.5t的核磁共振现象。1hlf-nmr的基本原理是通过对处于恒定磁场中的样品施加射频脉冲，使氢质子发生共振，质子以非辐射的方式释放所吸收的射频波能量后返回到基态，此过程称为弛豫过程。目前，lf-nmr技术以其快速、无损、样品需要量少且处理简单等特点，在食品科学的检测领域表现出了一定的应用潜力。李潮锐等基于单位质量干燥花生和纯花生油两者的脂肪弛豫谱峰面积之比获得与索氏抽提法相吻合的含油率，hanzhu等使用低场核磁共振技术检测了猪长肌中的持水量(waterholdingcapacity，whc)，宋平等通过核磁共振研究水分状态及变化过程和浸种方法对水稻种子吸水量的影响，王乐等通过核磁共振法鉴别食用植物油掺伪餐饮业废油脂，geirh.等使用低场核磁共振检测肉中脂肪和水含量等。但是，这些研究仅限于低水溶液的短弛豫体系，而高水体系，目前国内外尚未见应用低场核磁共振技术检测的技术。并且，现有技术中，很多低场核磁共振技术的研究只限于定性研究，定量研究更是少之又少。综上，低场核磁共振技术能准确检测低水体系中油脂含量，但是发酵液属于水体系(多为高水体系)，目前还没有文献报道其定量检测方法。因此，本领域还需要探寻准确检测水体系中油脂含量的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种定量测定培养液中油的方法。在本发明的第一方面，提供一种定量测定水体系中油含量的方法，所述方法包括：针对水体系样液，利用低场核磁共振仪测定，以面积质量比计算发酵液中油含量；所述的面积质量比是每克油对应的峰面积。在一个优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，所述的油是植物油；较佳地所述的油包括(但不限于)：大豆油，油菜籽油或棕榈油。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，所述的水体系是发酵液。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，所述的发酵液是白色链霉菌发酵生产盐霉素的发酵液。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，通过将油质量与峰面积做线性拟合，获得油质量。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，根据式(i)计算大豆油的质量：y＝12956.08927x-71.77(i)；式中，y表示峰面积，x表示油质量。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，对发酵液中的上清液利用低场核磁共振仪测定；较佳地，通过离心去掉发酵液中的固体物，获得上清液。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，所述的固体物包括：菌体和不溶性固含物；较佳地所述的不溶性固含物包括：黄豆粉，胚芽粉。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，所述的对发酵液进行离心，去掉固体物后再利用低场核磁共振仪测定包括：取发酵液离心，直接用移液枪吸取离心上清液，将该上清液加入玻璃试管，使用低场核磁共振仪进行测定。在另一优选例中，所述的定量测定水体系中油含量的方法中，所述的方法，检测到的最低油含量为1％(w/v)。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1不同质量的各组分的反演拟合。a：水的反演拟合图谱；b：油的反演拟合图谱；c：黄豆粉的反演拟合图谱；d：胚芽粉的反演拟合图谱。图2与峰面积和cpmg响应值(简称“响应值”)相关性拟合(a:水、b:油、c:培养基)。峰面积是指在t2弛豫时间下经过反演拟合得到面积。图3油质量与峰面积的线性拟合。图4正己烷萃取法与nmr法的相关性。具体实施方式本发明人致力于生物发酵领域的研究，发酵液一般属于水体系，在发酵需要的情况下会在发酵液中加入油。现有的定量测定油含量的技术步骤烦琐，准确性低。因此，本发明人进行了深入研究后，揭示了本发明的检测培养液中油的方法。如本文所用，所述的“水体系”是指以水为溶剂的溶液体系；较佳地，该“水体系”为“高水体系”。在该水体系中，含有油，通常油含量在大于0.1％(w/v)，更佳地在1％～70％(w/v)。本发明的方法的研究过程步骤如下：(1)在锥形瓶或发酵罐中注入一定量的培养基，保持培养基成分溶解均匀；(2)对培养基主要成分水、油、胚芽粉、黄豆粉进行单独检测，确定其在低场核磁共振仪下弛豫时间；(3)加培养基的锥形瓶或发酵罐经过灭菌，按一定量的接种量接入菌种；(4)通过比较水、油质量与响应值和相应峰面积的相关性，来确定表征油的量；(5)通过单因素变量来确定培养基中各成分对油检测的影响，各成分以培养基中含量为上限，然后依次递减至零，分五个梯度加入培养基；(6)单因素实验培养基成分分别为胚芽粉、黄豆粉、氯化钾、氯化钠、酒石酸铵、尿素、七水硫酸镁、三水磷酸氢二钾、碳酸钙；(7)取少量油0.1～1g进行低场核磁共振仪的灵敏度实验，建立了“面积质量比”；(8)分别以0％、0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％、2％、5％、8％的油含量进行梯度实验，验证方法的稳定性和精确性；(9)配制含油量不同的油水混合物进行低场核磁共振检测，排除其他培养基成分的干扰，再次验证方法的准确性和精确性；(10)不同样品处理方式的比较；(11)方法与传统的油检测方法正己烷萃取比较。经过上述过程的研究，通过对各种可能存在的干扰因素的分析，本发明人优化获得了检测水体系中油含量的方法，所述方法包括：利用低场核磁共振仪测定，以面积质量比计算发酵液中油含量；所述的面积质量比是每克油对应的峰面积。作为本发明的优选方式，所述的水体系是发酵液体系，所述的油是大豆油。更佳地，所述的发酵液是白色链霉菌发酵生产盐霉素的发酵液。作为本发明的优选方式，通过将油质量与峰面积做线性拟合，获得油质量。更佳地，根据式(i)计算大豆油的质量：y＝12956.08927x-71.77(i)；式中，y表示峰面积，x表示油质量。作为本发明的优选方式，定量测定水体系中油含量时，取样后，对发酵液进行离心，再利用低场核磁共振仪测定，从而消除了培养基中存在的干扰因素，以及消除了菌体导致的干扰。较佳地，所述的发酵液是白色链霉菌发酵生产盐霉素的发酵液；所述的去掉固体物包括：发酵菌体，黄豆粉，胚芽粉。本发明人还研究了几种排除固体物的方法对于检测准确率的影响，发现采用如下的方法较为准确：取发酵液(2ml)离心，直接用移液枪吸取离心上清液，将该上清液加入玻璃试管，使用低场核磁共振仪进行测定。本发明建立了一种方便、快捷、无损的低场核磁共振技术检测发酵液中油脂的方法：通过对培养基中各成分的检测，确定了油脂的弛豫时间；单因素变量实验证明了除了黄豆粉和胚芽粉造成取样不均对油峰面积有一定的影响，其他成分对油峰面积无影响；含油量不同的梯度实验表明了低场核磁共振技术检测油时有良好的稳定性和精确性。根据测定结果，本发明人通过离心步骤排除了影响检测的因素的干扰。传统的正己烷萃取测定油含量与低场核磁共振技术测得的油进行线性相关分析，相关性良好。并且，应用低场核磁共振技术检测发酵液时得到的结果比传统的检测方法更方便准确，是一种新的有效的方法。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。菌株：白色链霉菌(streptomycesalbus)a30，浙江升华拜克生物科技有限公司。试验中运用到的具体仪器及试剂如表1。表1、培养基所用试剂试剂名称纯度级别厂家黄豆粉浙江升华拜克生物科技有限公司提供胚芽粉浙江升华拜克生物科技有限公司提供大豆油浙江升华拜克生物科技有限公司提供酒石酸铵分子级生工生物工程(上海)股份有限公司尿素分子级生工生物工程(上海)股份有限公司氯化钠分析纯上海凌峰化学试剂有限公司氯化钾分析纯上海凌峰化学试剂有限公司七水硫酸镁分析纯上海凌峰化学试剂有限公司三水磷酸氢二钾分析纯上海凌峰化学试剂有限公司无水碳酸钙分析纯上海凌峰化学试剂有限公司正己烷分析纯上海凌峰化学试剂有限公司培养基的配制(g/l)：胚芽粉8、黄豆粉5、氯化钾2.2、尿素1.6、氯化钠1、酒石酸铵2、硫酸镁0.1、磷酸氢二钾0.2、碳酸钙5、大豆油150，用浓盐酸调节ph至7.0，121℃条件下灭菌30min。表2、仪器与设备低场核磁共振仪上海纽迈电子科技有限公司振荡器上海华连医疗器械有限公司水浴锅上海华连医疗器械有限公司磁旋搅拌器杭州仪表电机有限公司分光光度计上海菁华仪器科技有限公司发酵液是来自于摇瓶发酵培养，培养基组分同上，菌株的接种量10％，培养条件32℃、250r/min，摇瓶水平不控制通气量、溶氧等。隔天(第2、4、6、8、10天)取样。50l发酵罐发酵方法如下：装培养液量30l，接种量5-10％。控制条件如下：32℃，空气流量0.5-2.0vvm，do维持在10％或以上，罐压0.03-0.08mpa。实施例1、几种组分的驰豫时间分析本实施例中，进行几种组分的驰豫时间分析。培养基中成分复杂，先分别对培养基中主要成分水、油(大豆油)、黄豆粉、胚芽粉进行单独检测，探究其特性，为在培养基中对其有效分析提供依据。过程如下：分别量取不同质量的水、油、黄豆粉、胚芽粉至检测试管中，但是在试管内的高度不高于2cm，然后使用大豆油寻找中心频率及参数设定。各组分质量见图1的图例。检测结果如图1。水的弛豫时间约为2500ms，油的弛豫时间约为100ms，黄豆粉和胚芽粉的弛豫时间约0.1～1ms、2～15ms、20～400ms、2000～4000ms。实施例2、低场核磁共振技术检测中表征油的量的确定本实施例中，进行低场核磁共振技术检测中表征油的量的确定，过程如下：选取纯水、纯油和培养基作为确定响应值和反演峰面积哪个为表征油的量的物质；分别取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml纯水至检测试管，取0.6g、0.9g、1.4g、1.9g、2.6g大豆油至检测试管，取2ml含油量为0％、1％、2％、5％、8％、10％的培养基(未进行离心操作)至检测试管，然后进行低场核磁共振检测；水体积与响应值和相应的油峰面积做相关性拟合，结果如图2a，峰面积与体积的相关性大于响应值与水体积的相关性，所以峰面积表征水体积更好；油质量与峰面积和响应值进行线性拟合，结果如图2b，峰面积与油质量的相关性大于响应值与油质量的相关性，所以峰面积表征油质量更好；取相同体积含油量不同的培养基进行低场核磁共振检测，油峰面积和响应值与油质量进行相关性拟合，结果如图2c，油峰面积与油质量的相关性远大于响应值与油质量的相关性，所以用油峰面积表示培养基中油的质量更好。综上，使用峰面积定量表征培养基中油质量更合适。当纯油作为检测物的时候，峰起始时间约24ms，峰顶点时间100ms左右，峰结束时间305ms。然而，培养基的成分是复杂的，每种物质都可能对油脂峰的出峰时间、峰顶点时间、峰结束时间及峰面积大小等造成影响。实施例3、组分对于测定的影响分析从培养基的配制到低场核磁共振检测的整个过程，许多操作或组分都可能造成误差。为了确定每种物质对油脂峰面积的影响，本发明人对每种物质进行了深入的分析研究。将研究数据进行统计分析，一些测定结果如表3。表3、各组分影响下油峰面积*以每种组分为变量，设置六个梯度，每个梯度做3个平行。对以各个成分为变量的培养基进行低场核磁共振检测。本发明人发现，根据随着培养基组分含量的增加，在各组分的影响下，油峰面积并没有随之呈现规律性变化。通过计算各梯度油峰面积的平均值的变异系数，可知，碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、酒石酸铵、尿素的变异系数均小于7％，对油峰面积的影响较小，在可接受范围内；而黄豆粉和胚芽粉的变异系数分别为32.23％和19.52％，相对偏大，对培养基中油峰面积有较大的影响。因此，需要分析这种影响因素，以及考虑在测定过程中避免黄豆粉和胚芽粉对于测定结果的影响。实施例4、确定nmr对少量油的灵敏度量取少量的纯油进行低场核磁共振检测，以确定nmr对少量油的灵敏度，为此建立了“面积质量比”来表示，面积质量比即是每克油对应的峰面积。随着油质量的增加，面积质量比保持稳定，如表4。表4、少量油的nmr检测结果计算得平均值为12687.61，标准差为252.6915，变异系数cv＝1.9916％，说明低场核磁共振仪对油的敏感度与油质量多少无关。同时，油质量与峰面积做线性拟合，如图3，拟合曲线：y＝12956.08927x-71.77(i)；式中，y表示峰面积，x表示油质量，相关性良好，以此式用作培养基中含油量的计算。配制含油量不同的培养基(未进行离心处理)进行低场核磁共振检测，每个梯度五个平行，每次检测取样2ml，如表5。可知含油量低于0.8％的培养基中的油峰面积变化较小，可能是培养基中黄豆粉、胚芽粉等物质的影响，计算其平均值为563.11。计算每个梯度的五个平行样品的油峰面积的平均值、标准差及相对标准差。每个梯度的相对标准差都在合理的变化范围，各梯度的变异系数的平均值为4.42％，可知低场核磁仪检测的稳定性良好。然后计算了含油量大于0.8％培养基中油峰面积质量比，其值均和纯油的面积质量比相一致，平均值为12160.01，其准确性良好。表5、不同含油量培养基的nmr检测配制含油量为0％、0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％的油水混合物进行lf-nmr检测，结果如表6。可以看到，油含量达到0.8％以上的时候才能检测到油的存在，经过计算在油水混合物中油峰面积质量比和纯油检测时基本一致，同时也证明了培养基中其他成分对油峰面积的影响极小。表6、油水混合物的nmr检测实施例5、提高检测准确率如前所述，黄豆粉和胚芽粉影响检测准确率。此外，本发明人发现，在发酵液检测时，其中的菌丝体严重影响发酵液中油的检测。发酵液中菌丝体是随着发酵时间的进行而逐渐增大的，从而导致本应逐渐减小的油峰面积而逐渐增大。因此，本发明人经过反复研究，对样品进行不同方式的处理，找出合理的处理方式，进而对发酵液中的油进行准确检测。确定采用离心方式去掉发酵液中的菌体以及之前已确定对测量有影响的黄豆粉和胚芽粉。本发明人分别选择几种离心处理方式，依次为：a：取发酵液2ml离心(12000r/min离心10min)，直接用移液枪吸取离心上清液，转入玻璃试管，进行低场核磁共振仪测定；b：取发酵液3ml离心(12000r/min离心10min)，直接用移液枪吸取离心上清液，转入玻璃试管，进行低场核磁共振仪测定；c：取发酵液3ml，离心(12000r/min离心10min)后直接倒入试管，不用移液器，转入玻璃试管，进行低场核磁共振仪测定；d：滤芯离心管离心，装液量1ml，转入玻璃试管，进行低场核磁共振仪测定；g：正己烷萃取：取20ml发酵液加入20ml正己烷，振荡均匀，5000r/min离心10min；取上清倒入到干净的平皿(称其质量为w0)中，将剩下的发酵液再次用10ml的正己烷萃取，振荡均匀，5000r/min离心10min；取上层正己烷倒入之前的平皿中。将培养皿放置在60℃烘箱中，待正己烷挥发后，取出干燥后的培养皿，称重为w1，然后计算出发酵液中残油的含量。发酵液中油含量：随着发酵时间的进行，响应值呈现出无规律的变化，峰面积逐渐递减，结果如表7和表8，因此可知不经处理的发酵液直接进行lf-nmr测量，菌丝体的影响使得响应值和峰面积随发酵时间进行而呈现增大的趋势，同时，又验证了“峰面积表征发酵液中油含量比响应值更合适”。表7、发酵液不同处理方式时的cpmg响应值表8、发酵液不同处理方式时的峰面积表9、发酵液不同处理方式得到每毫升发酵液含油量由方程(i)计算得到每毫升发酵液的含油量和正己烷萃取得到的每毫升发酵液油含量，结果如表9。把正己烷萃取测得的油和用低场核磁共振测得的油做线性拟合，相关性良好，结果如图4，说明低场核磁共振检测可行。由表9可知，每毫升油含量b>a>g>d，可知低场核磁共振检测油含量的准确性高于传统的油检测方法。通过对已知含油量(1％、3％、5％、8％、10％)的培养基(组分同上)进行检测，利用正己烷以及本发明的方法(利用低场核磁共振，以峰面积表征，测定前，取发酵液2ml离心，直接用移液枪吸取离心上清液)测定的油含量结果如表10。表10、lf-nmr法与正己烷萃取法准确性比较由表9(针对发酵过程中的发酵液)和表10(针对油含量既定的发酵液)可见，两种方法检测到的油都低于真实值，但是本发明的lf-nmr法更接近真实值。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12