本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中沙丁胺醇的检测试剂盒。
背景技术：
β-肾上腺素受体激动剂，简称β-激动剂，是动物源性食品中检出率最高、危害最严重的化学性残留危害物。我国农业、卫生及食品药品监督管理等部门均明令禁止在畜禽养殖和食用农产品中添加β-激动剂。
沙丁胺醇为选择性β2受体激动剂，能有效地抑制组胺等致过敏性物质的释放，防止支气管痉挛。作为药物，沙丁胺醇广泛用于治疗哮喘等呼吸系统疾病，但摄入过量对人体危害较大，对于高血压、糖尿病等患者尤其危险。人如果摄入量过大或无病摄入该药，就可能出现副作用或中毒事故，表现为：肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、肌肉痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗。
目前，沙丁胺醇残留量常用的仪器分析检测高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用技术等。由于上述检测方法的样品前处理均需要使用净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗罗里硅土固相萃取柱、硅胶SPE固相萃取柱等。上述固相萃取柱价格昂贵，约为500～2000元/支，且净化步骤繁琐，需要多种有机溶剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种低成本、分离操作简便、检测结果准确的食品中沙丁胺醇的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中沙丁胺醇的检测试剂盒，包括偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁；所述的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠是由沙丁胺醇单克隆抗体与磁珠的质量比为1：20～40混合并溶于二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液中偶联制备而成；所述的沙丁胺醇单克隆抗体是由沙丁胺醇半抗原与兔血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得；所述的沙丁胺醇半抗原是采用混合酸酐法将沙丁胺醇与鸡卵清白蛋白偶联而得。
作为本发明进一步的方案：所述的沙丁胺醇半抗原的具体制备步骤为：将0.5mmol硫酸沙丁胺醇溶于15～18ml无水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室温下反应3.6～4.0h，离心，将下层固体溶于12～16ml的N，N-二甲基甲酰胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸异丁酯，继续反应2.0～2.5h；将上述反应液加入到14～18ml含有7～8mg/ml鸡卵清白蛋白的磷酸缓冲液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲液透析4～5次，冷冻干燥，得到沙丁胺醇半抗原。
作为本发明进一步的方案：所述的复溶液为含有0.55～0.70wt.%兔血清白蛋白、0.06～0.08wt.%吐温-20、0.01～0.015wt.%大庆霉素的磷酸盐缓冲液，偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。
作为本发明进一步的方案：或者含有0.58～0.62wt.%兔血清白蛋白、0.10～0.12wt.%吐温-20、0.008～0.012wt.%大庆霉素的pH值7.3～7.5的三羟甲基氨基甲烷-硼酸电泳缓冲液，偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。
作为本发明进一步的方案：所述的磁铁产生外加磁场，使偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。
利用所述的食品中沙丁胺醇的检测试剂盒进行检测的方法，步骤为：用试剂盒进行样品中沙丁胺醇的分离富集；将富集有沙丁胺醇的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲醇液，用于检测分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明试剂盒具有较高的特异性和准确性，对沙丁胺醇的捕获浓度可达到25μg/g（每克免疫磁珠可以捕获25μg沙丁胺醇），样品添加回收率≥88.2%；
2、本发明试剂盒中的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠与液体经磁力作用容易快速分离开来，分离过程简单，可省去离心和过滤等繁琐的操作过程，节约时间，在撤去外加磁场时，磁珠无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象；
3、磁珠具有一定的机械度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的这种物理化学性质稳定特点，使其磁性不易下降；
4、磁珠的润洗和洗脱分别用去离子水和甲醇，0.1mL的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠只需10mL去离子水润洗、0.5mL甲醇洗脱即可，所用试剂的量较少，磁珠的润洗和洗脱过程较环保。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中沙丁胺醇的检测试剂盒，包括偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠是由沙丁胺醇单克隆抗体与磁珠的质量比为1：20～40混合并溶于二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液中偶联制备而成，沙丁胺醇单克隆抗体是由沙丁胺醇半抗原与兔血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得；复溶液为含有0.55～0.70wt.%兔血清白蛋白、0.06～0.08wt.%吐温-20、0.01～0.015wt.%大庆霉素的磷酸盐缓冲液或者含有0.58～0.62wt.%兔血清白蛋白、0.10～0.12wt.%吐温-20、0.008～0.012wt.%大庆霉素的pH值7.3～7.5的三羟甲基氨基甲烷-硼酸电泳缓冲液，偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。磁铁产生外加磁场，使偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。
一、试剂盒的各组分的制备
1、沙丁胺醇半抗原合成
将0.5mmol硫酸沙丁胺醇溶于15～18ml无水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室温下反应3.6～4.0h，离心，将下层固体溶于12～16ml的N，N-二甲基甲酰胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸异丁酯，继续反应2.0～2.5h；将上述反应液加入到14～18ml含有7～8mg/ml鸡卵清白蛋白的磷酸缓冲液中，室温反应过夜（大约16h）；将上述反应液用磷酸缓冲液透析4～5次，冷冻干燥，得到沙丁胺醇半抗原。
2、免疫原的制备
取8～10mL沙丁胺醇半抗原，溶解于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，得到沙丁胺醇半抗原溶液；取25～30mg二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺用0.2～0.5mL水充分溶解后，加入沙丁胺醇半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取兔血清白蛋白50mL，使之充分溶解在4mL的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，接着缓慢滴加反应液A，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换5次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到沙丁胺醇免疫原；分装，于-20℃保存，得免疫原，备用。
3、沙丁胺醇单克隆抗体的制备
1）动物免疫：用上述制备出的免疫原按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
2）细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞混合，然后在45秒内缓慢加入预热的聚乙二醇4000进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5wt.%CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
3）杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接酶联免疫吸附方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入沙丁胺醇标准品溶液50μL，再加入细胞上清液50μL和羊抗鼠IgG-HRP50μL，于37℃反应30min，洗板，再加入底物显色液100μL，于25℃下避光反应15min，再加入终止液50μL，测定OD450nm值下降到对照孔的50%以下，判为阳性，经3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
4）单克隆抗体制备：将3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接酶联免疫吸附测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
5、偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠的制备
1）磁珠活化
表面有-COOH基团的磁珠（购于DYNAL，粒径为2.8μm），其含量是0.1eq/g～0.3eq/g，取100μL磁珠，用含有pH值5.0、0.05wt.％的吐温-20的浓度为20mmol/L的二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液100mL洗涤两次，磁分离后移除上清；磁珠活化前，用4℃贮存的含有pH值5.0、0.05wt.％的吐温-20的浓度为20mmol/L的二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液分别配制50mmol/L的二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺溶液；分别向装有磁珠的离心管中加入新配置的二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺溶液各50μL，涡旋混匀，室温活化30min；将离心管置于磁分离架上进行磁分离4min，移除上清液，再向其中加入100μL、pH值5.0、20mmol/L的二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液清洗3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。
2)偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠的制备
将5μg沙丁胺醇单克隆抗体溶解到60μL、pH值5.0、20mmol/L的二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液中，向其中加入5mg活化的磁珠，或将10μg沙丁胺醇单克隆抗体溶解到60μL、pH5.0、20mmol/L的二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液中，向其中加入5mg活化的磁珠，并用20mmol/L的二（2-羟乙基）亚胺基三（羟甲基）甲烷缓冲液定容至100μL，轻柔地混匀磁珠与沙丁胺醇单克隆抗体；4℃偶联2h，期间利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上进行磁分离5min，移除上清液；为了淬灭未反应的-COOH，可加入100μL，pH值7.3～7.4的三羟甲基氨基甲烷反应15min或100μL、pH值8.0、乙醇胺浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液封闭磁珠；用100μL、0.2wt.%兔血清白蛋白、0.1wt.%吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗封闭好的磁珠4次，将磁珠复溶于含0.2wt.%的兔血清白蛋白、0.08wt.%吐温-20、0.02wt.%NaN3的磷酸盐缓冲液中，于4℃保藏。
二、试剂盒的组建
组建检测沙丁胺醇磁免疫磁珠分离富集试剂盒，使其含有下列组分：
偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠
复溶液
磁铁
将偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠加入到复溶液中，至终浓度为8mg/mL。
三、试剂盒对样品中沙丁胺醇的分离富集方法
1）取溶有偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠复溶液0.1mL于10mL离心管中，用5mL去离子水润洗磁珠1次，将离心管在磁铁上静置4min，确保磁珠全部吸附在磁铁上，每次用磁铁分离磁珠和洗液；
2）将组织样本用均质器均质后，称取5.0±0.05g样品至样品瓶中，分别加入1.5±0.05g氯化钠，20mL50%甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min，室温下3000r/min离心5min，取5mL离心上清液与5mL去离子水混匀，再与偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠混匀，在室温下反应20min；
3）反应完成后，用磁铁分离磁珠，用5mL去离子水清洗磁珠，清洗两次；
4）将0.5mL甲醇加入到装有经过步骤3）清洗过的磁珠的10mL离心管中，混匀，静置1min，用磁铁分离磁珠，回收甲醇溶液，用于检测分析。
四、试剂盒质量的测定
1、试剂盒的捕获量和回收率
试剂盒捕获量的定义为：每毫克偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠可以捕获沙丁胺醇的最大量。制备沙丁胺醇浓度分别为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL样品溶液，每份猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品溶液为1mL，取沙丁胺醇单克隆抗体免疫磁珠0.1mL分别加入至上述样品中，用试剂盒进行样品中沙丁胺醇的分离和富集，并用沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒对用偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠处理过样品进行检测，测得结果如下：样品中沙丁胺醇浓度为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL和25ng/mL时，经上述食品中沙丁胺醇的检测试剂盒对样品中沙丁胺醇进行分离富集后，检测得出沙丁胺醇添加回收率范围为93.6～99.8%，当样品中沙丁胺醇浓度为30ng/mL时，得出沙丁胺醇添加回收率范围为88.2～91.4%，表明食品中沙丁胺醇的检测试剂盒对样品中沙丁胺醇的捕获量为25ng/mL。
2、特异性
以沙丁胺醇作为标准，设沙丁胺醇的交叉反应率为100%，用于试剂盒交叉反应性研究的药物均为与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物：克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基沙丁胺醇、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、齐帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林。猪尿、牛尿、羊尿、饲料、猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品中分别添加上述18种药物（包括沙丁胺醇）浓度为20ng/mL，按试剂盒步骤操作，对样品中沙丁胺醇进行分离富集后，再检测，检测结果显示试剂盒对沙丁胺醇具有较高的特异性，对与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。