本发明属于农药残留检测领域，涉及烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法。
背景技术：
马来酰肼又名抑芽单，是一种植物生长调节剂，烟草生产中常用其抑制烟草侧芽生长，国外应用比较广泛。由于其在烟草大田生长期的长期多次施用，从而会导致其在初烤烟叶中的残留, 烟叶中马来酰肼的残留会对吸烟者产生健康风险，国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）将其纳入烟草农药指导性残留限量名单118名单）。
烟草中马来酰肼残留量的分析方法主要有分光光度法（ISO4876-1980），高效液相色谱法（HPLC，YC/T405.5-2011）、气相色谱法（GC）和胶束液相色谱（MLC），烟草行业目前应用较为广泛的测定烟草中马来酰肼残留量的方法为HPLC-UV法（YC/T405.5-2011），此方法选取紫外检测器，灵敏度较低，方法的前处理非常复杂，且选取的是外标法定量，方法的准确度相对较低，容易出现假阳性检出现象。因此，准确定量分析烟草及烟草制品中马来酰肼具有较为重要的意义。
技术实现要素：
鉴于此，本发明目的在于提供一种准确定量检测马来酰肼的方法，特别是测定烟草及烟草制品中马来酰肼的方法。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种烟草及烟草制品中马来酰肼截留量的检测方法，所述烟草及烟草制品包括烟叶和卷烟烟丝，包括以下步骤：
步骤a）配制标准溶液；
准确称取马来酰肼标准品, 精确至0.0001g，用超纯水溶解定容，制得标准储备液；
稀释标准储备液得到标准工作液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存备用；
用超纯水准确配置氘代内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存；
取一定量的内标标准储备液，用超纯水稀释定容，制得内标标准工作液；
标准工作液和内标标准工作液冷藏保存；
步骤b）盐酸回流提取；
称取试样于圆底烧瓶中，加入盐酸提取液，再加入内标标准工作液；将圆底烧瓶放置于加热套或者油浴锅中，圆底烧瓶上安装球形冷凝管，加热回流；控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球处，回流稳定后开始计时；
步骤c）分散固相萃取纯化；
从圆底烧瓶中移取上清液于旋盖离心管中，分别向离心管中加入N-丙基乙二胺吸附剂，漩涡振荡混合，吸取上清液经有机相滤膜过滤后用超纯水稀释定容待测；
步骤d）UPLC-MS/MS分析测定；
分别对前述工作液进行UPLC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线；
色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3超高效液相色谱柱，柱长100 mm，内径2.1mm，粒径1.8μm；流动相A：体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B：体积分数为0.1%的甲酸乙腈溶液；流速0.45 mL/min；柱温45 °C；进样量2 µL；
梯度洗脱条件：0~2min，100%A~100%A；2~2.8min，100%A~30%A；2.8~3.0min，30%A~20%A；3.0~4.0min，20%A~5%A；4~6min，5%A~5%A；6~6.1min，5%A~100%A；6.1~8min，100%A~100%A；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压（IS）：3.0 kV；离子化温度500 ℃；雾化气流量：800 L/Hr； 锥孔气(cone)流量50 L/Hr； 碰撞气流量为0.15 ml/min； 碰撞气为氩气，其余气体为氮气； 驻留时间为100 msec，正离子MRM模式采集。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤a）中，内标标准储备液为氘代内标，所述氘代内标为马来酰肼-d2。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤b）中，称取试样的重量为5g，精确到0.01g。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤b）中，圆底烧瓶中加入盐酸提取液体积为50mL,浓度为4mol/L，加入氘代内标体积为250 μL，浓度为0.2 mg/mL。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤b）中，加热套的温度为180℃。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤b）中，油浴锅的温度为150℃。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤b）中，加热回流的时间为1h。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，步骤c）中，所述离心管的体积为2 mL，加入PSA吸附剂的质量为25mg。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤c）中，涡旋振荡速率为2000 r/m，时间为2 min。
根据本发明烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法的一个具体实施方式，所述步骤d）中，标准曲线的回归方程为Y=0.001X+0.0022，相关系数r=0.9995。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a)本发明针对烟草抑芽剂马来酰肼，利用超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC–MS/MS），建立UPLC–MS/MS快速分析烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的方法。选取的串联质谱，分离度和灵敏度都明显高于标准方法（YC/T 405.5-2011）的紫外检测器。
b)发明人在实施本发明的过程中，尝试了不同的萃取方式以及不同的萃取材料以及加入量，最终得到一个优化的萃取方案。
c)发明人在实施本发明的过程中，尝试了多种UPLC和HPLC色谱柱，包括UPLC HSS T3，UPLC BEH Shield RP18，Hypercarb Porous Graphitic Carbon和Atlantis dC18等，最终选择了UPLC HSS T3柱，配合本发明的流动相体系，能够获得更好的分离度与峰形。
d)发明人尝试了多种不同的流动相体系，最终确定了0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈体系与UPLC HSS T3柱配合，能够获得更好的分离度与峰形。
e)发明人选用了适当的梯度洗脱程序使得所述五种马来酰肼完全分离，整个梯度洗脱时间为8 min，与标准方法相比显著缩短了分析时间(20 min)。
附图说明
图1是本发明样品的选择离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合一个具体实施例进行说明。
1、试剂和仪器
马来酰肼和马来酰肼-d2标准品来自于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：≥98.5%，Augsburg，德国），甲酸 (HPLC级，德国Sigma公司)；甲醇，乙腈（色谱纯，美国Thermo-Fisher公司），盐酸（分析纯，西陇科学股份有限公司），N-丙基乙二胺（PSA）购自安捷伦公司（美国），水为超纯水。
超高效液相色谱-串联质谱仪(Xevo TQ，美国Waters公司)，配备电喷雾电离源（ESI）；涡旋振荡器（VtexMixer 230VeU，美国Labnet公司）。
2、标准溶液配制
准确称取10 mg的马来酰肼标准品，精确至0.0001g, 用超纯水溶解定容至10 mL，制得1.0 mg/mL标准储备液，-20℃保存。取一定量的所述标准品储备液，用超纯水稀释定容，制得200 μg/mL标准工作液。
准确配置1.0 mg/mL马来酰肼-d2内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的所述内标标准储备液，用超纯水稀释定容，制得200 μg/mL内标标准工作液。所有的工作液于冰箱-20℃保存，使用前将其恢复到室温。
3、加热回流萃取
称取5 g试样于容积为250mL的圆底烧瓶中，精确至0.01g。加入50 mL盐酸提取液，加入250μL 200μg/mL氘代内标，适当振摇或超声，使烟末分散与盐酸溶液混合均匀。将烧瓶放置于加热套或者油浴锅中，装上球形冷凝管，加热回流。控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球处，回流稳定后开始计时，回流1小时。作为优选，将加热套温度设置为180℃，或者油浴锅温度设置为150℃，当然，本领域技术人员可以根据实际回流情况作相应调整。回流结束后，关闭加热套或油浴锅电源，冷却至室温。
4、分散固相萃取净化
移取1mL上清液于旋盖离心管，加入25mgPSA吸附剂，漩涡振荡混合2 min，2000 r/m，吸取上清液经水机相滤膜过滤，移取500μL滤液，并用超纯水稀释定容到1mL后待测。
5、LC-MS/MS条件
色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3超高效液相色谱柱，柱长100 mm，内径2.1mm，粒径1.8 μm；流动相A：体积分数为0.1%的甲酸水溶液；流动相B：体积分数为0.1%的甲酸乙腈溶液；流速0.45 mL/min；柱温45 °C；进样量2 µL；
梯度洗脱条件：0~2min，100%A~100%A；2~2.8min，100%A~30%A；2.8~3.0min，30%A~20%A；3.0~4.0min，20%A~5%A；4~6min，5%A~5%A；6~6.1min，5%A~100%A；6.1~8min，100%A~100%A；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压（IS）：3.0 kV；离子化温度500 ℃；雾化气流量：800 L/Hr; 锥孔气(cone)流量50 L/Hr; 碰撞气流量为0.15 ml/min; 碰撞气为氩气，其余气体为氮气; 驻留时间为100 msec，正离子MRM模式采集。监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见表1。
表 1 多反应监测模式下马来酰肼及其内标的部分质谱参数
注：*为定量离子对。
4、标准曲线和检出限
分别移取标准工作液5μL，12.5μL，50μL，125μL，250μL和500μL标准工作液到7个10mL棕色容量瓶中，每个容量瓶移入25μL内标工作液（200μg/mL），配制成溶剂配制标准工作曲线。基质匹配标准曲线的配制方法为分别移取500μL每个标准工作曲线溶液于7个1.8mL旋盖色谱瓶，加入500μL空白烟叶样品萃取液，用超纯水定容至1mL，马来酰肼的线性范围50ng/mL-5000ng/mL。分别对这些标准溶液进行UPLC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线，回归方程为Y=0.001X+0.0022，相关系数r=0.9995。以3倍信噪比确定方法的检出限，各种烟叶基质中马来酰肼的LOD范围为0.624-987 ng/mL。
5、方法的回收率
选取不含马来酰肼的烟叶样品，向烟叶样品中添加的标准溶液，分别按照“样品的提取和净化”的方法处理样品后上机检测，然后计算样品中马来酰肼的回收率。每个水平测5次，得出马来酰肼平均回收率在105.9－111.8％之间，RSD范围为3.3%-9.1%。
本实施例对烟草中马来酰肼残留进行快速分析，采用加热回流法提取烟叶中的马来酰肼，基质分散固相萃取法净化，氘代内标定量，UPLC-MS/MS分析检测，总分析时间为8 min。建立的方法分析时间短，灵敏度高。