利用直接质谱成像技术判别莲子新陈度的方法与流程

本发明涉及莲子新陈度的辨别方法，具体地指一种利用直接质谱成像技术判别莲子新陈度的方法。

背景技术：

质谱成像(Imaging Mass Spectrometry，IMS)技术是一种以待测样品的质谱信息为基础对待测样品(一般多为生物组织)进行多点重建来显示样品中多种分子的空间分布的成像技术。与其它常见技术(如PET成像、NMR成像及各种光谱成像)相比，质谱成像技术除了具有获得影像的能力这一基本特点外，还具备了高灵敏度、高特异性和多组分同时检测、无需放射性核素标记或荧光标记、不使用放射源等优点，可望发展成为理想的分子化学成像工具。

具体步骤：首先将样品(如病理组织等)进行切片，然后添加一定的基体物质，制备好能够进行分析的待测样品；样品表面任何一点(即最小的采样面积)均可以进行相应的质谱分析，获得该点内不同组分的质谱图。不同的组分由于分子量不同导致质荷比不同，在质谱中出现的位置不同，从而得到了很好的质量分辨。当样品或采样点沿着x或y方向移动时，由于不同位点的化学成分不同(虽然光学成像的形貌等可能一样)，则获得的质谱信息(如峰的丰度和位置等)不同。如果将质谱信息(如特定质荷比的质谱峰)与样品中的空间位置进行关联，则可以获得该组分的质谱影像。显然，质谱的影像与其它技术如光谱影像存在较大的区别，而且能够产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可充分展示细节部分，具有更加丰富的信息量。

技术实现要素：

本发明的目的就是要克服现有技术所存在的不足，提供一种利用直接质谱成像技术判别莲子新陈度的方法。

为实现上述目的，本发明利用直接质谱成像技术判别莲子新陈度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品的前处理：将莲子切片；

2)质谱分析：设置DAPCI离子源为正离子检测模式，质量范围为50～700Da，电离电压为2.5～3.5kV，离子传输管温度为200～300℃；解吸气(N2)气压为0.1～0.3MPa，以α为30度角喷出，解吸气温度为150～250℃；喷雾溶剂为甲醇，流速为3.5～4.5μL/min；将莲子切片置于具有三维调节功能的样品台上，使解吸气出口到测定点距离为1～2mm，测定时线性地改变样品台位置，每间隔0.25mm采集一次数据；质谱采集距离为18mm，选定离子的隔离宽度为1.0Da；

3)成像方法：记录各采样点的离子净响应信号的平均值，将各点数据(z值)按其相应空间坐标位置(x，y)输入Excel工作表中，再由Excel导入到surf软件中，设置视图格式为影像视图，即获得影像图；

4)PCA和CA分析：记录不同年份莲子的质谱数据，输入Excel工作表中，再由Excel导入到Matlab 2016a和SPSS 19.0中，得到相应的PCA图和CA聚类图；

5)分析结果：从PCA和CA分析可以看出不同年份的莲子可以按年份聚集在一起；从质谱图可以看出新鲜莲子的小分子物质较少，陈莲子的小分子物质较为丰富；从质谱影像图可以看出新鲜莲子中m/z132分子含量低，无法呈现出清晰的影像图，陈莲子中m/z132分子含量高，可以呈现清晰的影像图。

DAPCI离子源采用常压电晕放电产生试剂离子，离子化效率高，对纺织品、纸张、药品、食品等实际样品中各种待测物均具有较高的灵敏度。

本发明采用DAPCI-MS技术获取莲子切片的质谱数据，结合surf成像软件实现对莲子切片的质谱成像，结合PCA和CA实现对不同年份的莲子区分。该成果只需将莲子简单切片即可进行质谱扫描，可简单、快速、高效的获取莲子样品信息，对新、陈莲子快速鉴别。本发明能与实际相结合，较好的开发与应用，大大提高莲子新陈甄别技术水平，具有明显的经济效益。

附图说明

图1为DAPCI-MS成像装置图。

图2A为2009年莲子的一级质谱图。

图2B为2010年莲子的一级质谱图。

图2C为2012年莲子的一级质谱图。

图2D为2013年莲子的一级质谱图。

图2E为2014年莲子的一级质谱图。

图2F为2016年莲子的一级质谱图。

图3A是图2A在50-200Da段的放大图。

图3B为2009年份莲子切片图。

图3C为一级离子m/z132为信号的2009年份莲子质谱成像图。

图4A是图2F在50-200Da段的放大图。

图4B为2016年份莲子切片图。

图4C为一级离子m/z132为信号的2016年份莲子质谱成像图。

图5A为基于DAPCI-MS莲子的PCA的3D图。

图5B为基于DAPCI-MS莲子的PC 1-PC2的2D图。

图5C为基于DAPCI-MS莲子的PC 1-PC3的2D图。

图5D为基于DAPCI-MS莲子的PC2-PC3的2D图。

图6为基于DAPCI-MS莲子的CA的载荷图。

图7为不同年份莲子的冰状图。

图8为不同年份的莲子分层聚类的树状图

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。

本发明所用的试剂：甲醇(色谱纯)。

本发明所用的仪器：DAPCI离子源，实验室自制,配有可控温解吸气加热装置,解吸气出口喷嘴直径为0.1mm,其中的放电针直径为0.05mm,空间分辨率约为0.25mm×0.25mm。LTQ XL增强型线性离子阱质谱仪,配有Xcalibur数据处理系统(美国Finnigan公司)。

本发明所用的材料：莲子品种为太空莲3号，由江西省广昌县莲子科学研究科所提供，莲子成熟后，去种皮和胚芽，烘干后真空包装，并在室温(23±2℃)下避光保存。

实施例

1)样品的前处理：将莲子切片；

2)质谱分析：设置DAPCI离子源为正离子检测模式，质量范围为50～700Da，电离电压为2.5～3.5kV，离子传输管温度为200～300℃；解吸气(N2)气压为0.1～0.3MPa，以α为30度角喷出，解吸气温度为150～250℃；喷雾溶剂为甲醇，流速为3.5～4.5μL/min；将莲子切片置于具有三维调节功能的样品台上，使解吸气出口到测定点距离为1～2mm，测定时线性地改变样品台位置，每间隔0.25mm采集一次数据；质谱采集距离为18mm，选定离子的隔离宽度为1.0Da；

3)成像方法：记录各采样点的离子净响应信号的平均值，将各点数据(z值)按其相应空间坐标位置(x，y)输入Excel工作表中，再由Excel导入到surf软件中，设置视图格式为影像视图，即获得影像图；

4)PCA和CA分析：对2009、2010、2012、2013、2014、2016六年的莲子采集质谱数据如图2A～F，将各年份莲子的质谱数据输入Excel工作表中，再由Excel导入到Matlab 2016a和SPSS 19.0中，得到相应的PCA图和CA聚类图；

5)分析结果：从PCA和CA分析可以看出不同年份的莲子可以按年份聚集在一起；从质谱图可以看出新鲜莲子的小分子物质较少，陈莲子的小分子物质较为丰富；从质谱影像图可以看出新鲜莲子中m/z132分子含量低，无法呈现出清晰的影像图，陈莲子中m/z132分子含量高，可以呈现清晰的影像图。

结果与讨论

m/z 110在莲子中的质谱影像

按本发明的方法对2016年7月的新鲜莲子和2009年7月的陈化莲子进行质谱检测，两个年份的莲子质谱图与空白对照，结果表明，两个年份的莲子质谱图都出现了m/z 110离子峰，空白对照的没有出现m/z 110，m/z 110可能是莲子中的一个标记物。以m/z 110为目标信号分别对2016年7月份的新莲子和2009年7月份的陈化莲子做扫面，将所得的质谱数据导入surf软件作图，所得图像见图3A～C、4A～C。

由图3A～C和图4A～C表明，2009年的陈化莲子以m/z 132为目标信号做的质谱成像图与2009年的陈化莲子的切片图基本相同。本发明通过以m/z132分子离子对2009年和2016年份的莲子分别成像发现：2009年份的莲子可以呈现出清晰的影像，而2016年份的不能。2009年的陈化莲子中m/z 132在整个莲子切片中均有分布，m/z 132信号强度由外向内增强；2016年的新鲜莲子以m/z 132为目标信号做的质谱成像图与2016年的新鲜莲子的切片图的轮廓匹配度不高，信号强度弱，很零散。可能随着莲子的陈化过程，渐渐的产生了m/z 132这一分子离子。m/z 132这一分子离子可望作为区别莲子新陈的标记。

从图3A～C、图4A～C还可以看出，2009年份莲子质谱图在50-150Da段小分子物质明显比2016年份莲子的多，而在150-200Da段相反。

不同年份莲子的PCA和CA分析

对2009、2010、2012、2013、2014和2016年6个年份的莲子共70个样本在正离子模式下所获得的DAPCI-MS指纹谱图信息，导入Matlab中进行PCA数据处理与分析，分别得到的三维PCA得分结果，获得区分不同年份莲子。主成分1(PC1)占总方差贡献率的53.9％，主成分2(PC2)占19.1％，主成分3(PC3)占9.5％，其累计方差贡献率是82.5％(如图5A、5B所示)。其中，PC1贡献率的53.9％，描述了数据集合中最大变量的方向，沿着PC1的方向，除2013年和2016年的白莲有部分重叠外，其余年份的莲子之间具有较好的区分效果。能够区分在PCA三维空间的不同的区域。

由图6载荷图可知，loading值(载荷值的绝对值)越大离子，对样品区分的贡献率就越大，因此对PC1贡献最大的质谱信息来自m/z 225、239和m/z 299(在正方向上)等。如图5B所示，六个不同年份的莲子在PC2方向可得到较好的区分。分析PC2的载荷数据可知，对PC2贡献较大的离子是m/z 224、m/z 225、m/z 239和m/z 299，另外其他分子信号如m/z 264，m/z 300，这意味着不同年份的莲子之间在成分上具有较大区别。从图5C可以看出2009年份莲子聚集在PC1负方向和PC3正方向区域内，从图5B可以看出2010年份莲子聚集在PC1和PC2正方向区域内，从图5D可以看出2012年份莲子聚集在PC2和PC3负方向区域内，从图5D可以看出2013年份莲子聚集在PC2正方向和PC3负方向区域内，从图5C可以看出2014年份莲子聚集在原点区域附近，从图5C可以看出2016年份莲子聚集在PC1和PC3负方向区域内。

此外，对2009、2010、2012、2013、2014和2016年6个年份的莲子共60个(每个年份各10个)样本在正离子模式下所获得的DAPCI-MS指纹谱图信息，导入SPSS中进行分层聚类分析，相应的冰状图如图7所示和聚类结果如图8所示可以。从图8可以看出当临界值取9时，2016年份的莲子和2013年份有小部分交叉，2009、2010、2012、2014年份的莲子都可以按各自年份聚成一类。