本发明涉及一种基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法。
背景技术：
中药在遣药组方时讲究“药之生熟”，效性有异，功用不同。中药炮生为熟不仅在形态、色泽等方面会发生变化，其化学成分和药理作用也会相应改变。如乌头由生炮熟后毒性减弱，与其乌头碱的水解密切相关。
作为“伤科之圣药、止血之神药、理血之妙品”的名贵药材三七，在数百年的传统中医及民间用药历史中，被认为有“生打熟补”之说，其中，“打”是指生三七能止血活血、消肿定痛，“补”是指熟三七能补血理血、补益强身和提高人体免疫力等。现代药理研究对这一传统用药理论所体现的效用差异进行了考察，发现三七炮生为熟后其在止血、活血、抗氧化和补血等方面的药效作用均发生了变化。但是，临床使用三七并未将生熟明显区分，生三七及其炮制品熟三七常作为同一饮片使用，国外如新加坡等东南亚市场上也有多种生、熟三七制品在作为补品“三七”销售。即使对于熟三七，炮制时间和温度的不同也会导致最终制品功效的差异。2015年版《中国药典》中，只收载了三七药材及其饮片三七粉，并未收录其他炮制品种，说明生熟药材功效差异的这一客观真实性还未被国家法典所承认。对于国外使用者甚至大部分国内消费者来说并不了解中药在遣药组方时讲究“药之生熟，生熟各异，各有其功，用法不同”的规则，也缺乏明确的质控方法及标准对这一效用差异进行区分，因此使用者容易在应用中因无法辨识生、熟三七而造成混用、错用，导致药效的降低甚至不良效果。加上生、熟三七均属贵细且市场流通大品种中药的商品属性，目前这种“异药同标”的质控方法，给其相关产业的发展也带来很大障碍。
三七“生打熟补”效用有异，物质层面原因在于三七炮制后所含化学成分的含量、相对比例甚至结构均发生了明显变化。许多国内外科研工作者针对三七在蒸制过程中化学成分含量的变化进行了分析，发现随着蒸制时间的延长，三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和三七皂苷R1含量降低，而其它人参皂苷如Rh1、Rk3、Rh4、20(R/S)-Rg3、Rh2等成分含量却出现了不同程度的增加。分析其原因在于三七皂苷类成分在蒸制过程中由于高温高压的施加，糖苷键容易发生裂解，脱掉部分糖基，同时可能伴随侧链的脱水反应和C-20的构型变化，转化为其他含糖基较少的皂苷。而生三七中主要皂苷类成分被认为是起止血活血作用的主要活性成分，加热后这类成分被破坏，导致三七止血活血、消肿定痛的功效下降。而熟制三七中出现的新增加成分被证明具有对抗多种肿瘤、抗氧化等的功效，这也许是熟三七被作为滋补扶正药物使用的原因之一。
然而，现行质控方法“异用同标”，对于任一功用都采用相同的成分指标来进行质量把关，临床效用关联不强。且生、熟三七成分组成及含量差异大，仅用化学分析的方法孤立地检测任何一种或几种指标成分的含量，却不考虑与不同药效的关联，不仅难以反映三七的临床功用，也未能实现生、熟三七效应差异的有效表征。
因此，若能建立一套综合地既能关切生、熟三七不同临床功效，又不会增加施行难度的效用表征体系和质控方法，不仅对区分生、熟三七主要功效以指导实践使用有着客观量化的标示作用，更能为三七质量评价标准的完善、为中药“生熟异用、因效制宜”提供思路借鉴与方法参考，这对于三七有效性和安全性的保证，以及相关产业的健康发展具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种综合地既能关切生、熟三七不同临床功效，又不会增加施行难度的效用表征体系和质控方法，不仅对区分生、熟三七主要功效以指导实践使用有着客观量化的标示作用，更能为三七质量评价标准的完善、为中药“生熟异用、因效制宜”提供思路借鉴与方法参考的基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法，包括步骤：
1)测量生熟三七中药效相关的活性成分含量；
2)测定活性成分的抗凝血效应及抗氧化效应；
3)分别计算三七抗凝血生化整合指数及抗氧化生化整合指数；
4)根据抗凝血及抗氧化生化整合指数来指导三七的生熟异用。
作为优选的技术方案，所述生化整合指数是抗凝血生化整合指数及抗氧化生化整合指数。
作为优选的技术方案，所述步骤1)中的活性成分为人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd，Rh1，Rk3，Rh4和20(R)-Rg3。
作为优选的技术方案，所述步骤3)中计算三七抗凝血生化整合指数：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；其中，XRg1、XRe、XRb1、XRd分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的重量百分含量。
作为优选的技术方案，所述步骤3)中计算抗氧化生化整合指数：
BCI抗氧化＝0.1978*XRh1+0.2242*XRk3+0.1456*XRh4+0.1586*X20(R)-Rg3；其中，XRh1、XRk3、XRh4、X20(R)-Rg3分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rh1，Rk3，Rh4和20(R)-Rg3的重量百分含量。
作为优选的技术方案，所述生三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥主根、剪口、侧根及饮片。
作为优选的技术方案，所述熟三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen不同温度下蒸制的主根、剪口和饮片。
由于采用了上述技术方案，一种基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法，包括步骤：1)测量生熟三七中药效相关的活性成分含量；2)测定活性成分的抗凝血效应及抗氧化效应；3)分别计算三七抗凝血生化整合指数及抗氧化生化整合指数；4)根据抗凝血及抗氧化生化整合指数来指导三七的生熟异用；本发明基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法是以三七传统用药理论为导向，整合生物效应检测和化学成分分析的生熟三七质量个体化控制方法，能解决生、熟三七质量差异性控制的问题，并为三七生产、采供和使用提供客观量化的参考依据，减少由于生熟混用引起的疗效下降或不良反应增加，提高中药临床用药水平，有利于三七有效性和安全性的保证，同时为中药“辩证用药、辨质用药”提供方法及思路借鉴。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一种基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法，包括步骤：
1)测量生熟三七中药效相关的活性成分含量；
2)测定活性成分的抗凝血效应及抗氧化效应；
3)分别计算三七抗凝血生化整合指数及抗氧化生化整合指数；
4)根据抗凝血及抗氧化生化整合指数来指导三七的生熟异用。
所述生化整合指数是抗凝血生化整合指数及抗氧化生化整合指数。
所述步骤1)中的活性成分为人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd，Rh1，Rk3，Rh4和20(R)-Rg3。
所述步骤3)中计算三七抗凝血生化整合指数：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；其中，XRg1、XRe、XRb1、XRd分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的重量百分含量。
所述步骤3)中计算抗氧化生化整合指数：
BCI抗氧化＝0.1978*XRh1+0.2242*XRk3+0.1456*XRh4+0.1586*X20(R)-Rg3；其中，XRh1、XRk3、XRh4、X20(R)-Rg3分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rh1，Rk3，Rh4和20(R)-Rg3的重量百分含量。
所述生三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥主根、剪口、侧根及饮片。
所述熟三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen不同温度下蒸制的主根、剪口和饮片。
实施例：
基于生化整合指数指导三七生熟异用的方法可对生熟三七药材及饮片的抗凝血及抗氧化活性进行评价。
试验中所用到的仪器：粉碎机(FW-135型，上海隆拓仪器设备有限公司)；电子分析天平(CP114型，上海奥豪斯仪器有限公司)；超声波清洗仪(BL10-250A型，上海比朗仪器有限公司)；旋转蒸发仪(RE-5205型，上海亚荣生化仪器厂)；电热恒温水浴锅(DZKW型，北京市永光明医疗仪器有限公司)；压力蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-100SII-01-00，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；LC-20AB高效液相色谱仪(SPD-20A检测器，日本岛津公司)；超纯水器(UPT-1-20T优普系列，成都超纯科技有限公司)；台式高速冷冻离心机(H1650R型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；血凝仪(XN06系列，武汉景川诊断技术股份有限公司)。
(1)测量生熟三七样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rh1、Rk3，Rh4和20(R)-Rg3的含量：
(i)三七粉制备：将采自不同产地的生熟三七主根、剪口、侧根和饮片洗净、晒干、粉碎，过40目筛。
(ii)三七水提物制备：分别称取不同三七粉末各5g，每次加入50mL水，80℃下回流提取2次，每次2小时，合并滤液，减压提取液，浓缩至50mL生药浓度为0.1g.mL-1的水提液备用。
(iii)混合对照品溶液制备：分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rh1、Rk3，Rh4和20(R)-Rg3对照品置于2mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成质量浓度分别为0.55、0.50、0.60、0.50、0.60、1.00、1.00、0.55mg/mL的混合对照品溶液。
(iv)供试品溶液制备：分别取三七各样品粉末0.30g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定质量，放置过夜。超声处理40min，冷却至室温，称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
(v)液相色谱法测量：
色谱条件：色谱柱：Vision HT C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱：(0～20min，20％B；20～45min，20％～46％B；45～55min：46％～5％B；55～60min：55％B)；检测波长：203nm；流速：1.0mL/min；柱温：24℃；进样量：10μL。
测量结果如表1所示。
表1不同生、熟三七样品活性成分的含量(％，n＝3)
(2)测定活性成分的抗凝血效应(抗凝血酶活性)及抗氧化效应(羟基自由基清除活性)：
(i)活性成分的抗凝血效应(抗凝血酶活性)测定：
①样品溶液配制：精取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd分别用生理盐水配制成浓度梯度为0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液。
②抗凝血效应检测：
小鼠眼球静脉取血，全血与抗凝剂(0.109mol/L枸橼酸钠)9:1混匀，2500r/min离心15min制备待测血浆。以血浆：生理盐水＝2:1比例共50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的0.1mol/L PH 7.4Tris-HCl缓冲液稀释的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT0。每个样品至少重复测3次。
用不同浓度的凝血活酶，测得凝血酶原时间PT，计算PT延长率(％)。
PT延长率(％)＝(PT-PT0)/PT0*100％。
以lgPT延长率(％)对凝血酶原复合物浓度作图，得到凝血活酶浓度对lgPT延长率(％)的影响的标准曲线。
血浆-单体皂苷(2：1)混合血浆样品50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT'，计算lgPT'延长率(％)。
PT'延长率(％)＝PT'(加单体皂苷)-PT0'(生理盐水)/PT0'(生理盐水)*100％；
根据标准曲线相对应的凝血活酶浓度(Ui)，并计算对应的凝血活酶 抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％
相应数据通过Origin 8.5软件(Origin Lab公司，美国)作图。利用Graphpad Prism 5(Graphpad Software公司，美国)进行抗凝血效应EC50计算。结果见表2。
表2生、熟三七中活性成分抗凝血效应
(ii)活性成分的抗氧化效应(羟基自由基清除活性)测定：
①样品溶液配制：精取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rh1、Rk3、Rh4、及20(R)-Rg3分别用生理盐水配制成浓度梯度为25、50、75、100、125、150、175、200μmol/L的溶液。
②抗氧化效应检测：
经过考察，与DPPH自由基清除活力相比，生熟三七活性成分对羟基自由基具有更明显的清除活力，因此，本发明采用Fenton反应来测定活性成分的羟基自由基清除活性。
依次向具塞试管中加入60μL1.0mM FeCl2溶液，90μL1.0mM 1,10-菲咯啉溶液，2.4mL 0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.8)，150μL 0.17M H2O2溶液及1.5mL不同浓度的上述活性成分单体溶液。充分摇匀后，于室温孵育5min，在560nm处用紫外分光光度计测定吸光度。
羟基自由基清除活性的计算公式如下：
清除率＝[1-(A1-A2)/A0]*100％；
A0代表无样品溶液的吸光度，作为空白对照；
A1代表加入不同浓度活性成分单体溶液后的吸光度；
A2代表无1,10-菲咯啉溶液时的吸光度。
生、熟三七中上述活性成分抗氧化效应结果见表3。
表3生、熟三七中活性成分抗氧化效应
(3)三七抗凝血生化整合指数及抗氧化生化整合指数的计算：
由表1结果可看出，人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd含量随着炮制温度的升高及时间的延长逐渐降低，人参皂苷Rh1、Rk3、Rh4、和20(R)-Rg3含量随着炮制温度的升高及时间的延长逐渐升高；根据表2和表3结果可知，人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd抗凝血效应显著优于人参皂苷Rh1、Rk3、Rh4、和20(R)-Rg3，而抗氧化效应除Rb1较差外，其余无明显差异。结合含量变化及效应检测数据，选择人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd为抗凝血效应的指标成分建立三七抗凝血生化整合指数，选择人参皂苷Rh1、Rk3、Rh4、和20(R)-Rg3为抗氧化效应的指标成分建立三七抗氧化生化整合指数。
根据活性成分抗凝血及抗氧化效应，取各成分EC50倒数进行归一化，为生、熟三七活性成分分配抗凝血及抗氧化效应权重分配，将分配完权重的成分含量进行加和，以具有最大成分效应加和值的样品作为对照，其余样品与对照样品的比值即为该批三七的抗凝血生化整合指数BCI抗凝血及抗氧化生化整合指数BCI抗氧化，分别为公式I和公式II：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd-----公式I
BCI抗氧化＝0.1978*XRh1+0.2242*XRk3+0.1456*XRh4+0.1586*X20(R)-Rg3-----公式II XRg1、XRe、XRb1、XRd、XRh1、XRk3、XRh4、X20(R)-Rg3分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rh1，Rk3，Rh4和20(R)-Rg3的含量，％。
将上述24批三七样品的活性成分含量代入公式I和公式II，计算各批样品的抗凝血生化整合指数BCI抗凝血及抗氧化生化整合指数BCI抗氧化。
(4)验证生化整合指数对生熟三七药效活性的代表性：
(i)抗凝血生化整合指数的验证
①样品溶液配制：将上述生、熟三七水提物分别用生理盐水稀释为1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，9.0mg/mL等不同浓度梯度。
②抗凝血效应检测：
采集健康小鼠静脉血，立即与0.109mol/L枸橼酸钠溶液按9:1的比例充分混合均匀。以每分钟3000转离心10～15min分离出上层贫血小板血浆。将上述配制成的不同浓度生、熟三七水提物溶液分别按1:2比例与贫血小板血浆混合均匀，即得待测混合血浆。血浆-单体皂苷(2：1)混合血浆样品50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT'，计算lgPT'延长率(％)。
PT'延长率(％)＝PT'(加提取物)-PT0'(生理盐水)/PT0'(生理盐水)*100％；
根据标准曲线相对应的凝血活酶浓度(Ui)，并计算对应的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％。
③相应数据通过Origin 8.5软件(Origin Lab公司，美国)作图。利用Graphpad Prism 5(Graphpad Software公司，美国)进行抗凝血效应EC50计算。
④将不同生、熟三七水提物的活性成分Rg1、Re、Rb1、Rd含量值带入公式I，计算它们的BCI抗凝血，将各样品的实测EC50与BCI抗凝血进行相关性分析，结果如表4所示，说明二者具有显著相关性，BCI抗凝血能较好地代表生、熟三七药材抗凝血效应，且能看出生、熟三七抗凝血效应存在较大差异性。
表4生、熟三七BCI抗凝血与实测抗凝血效应的相关性分析
(ii)抗氧化生化整合指数的验证
①样品溶液配制：样品溶液配制：将上述生、熟三七水提物分别用生理盐水稀释为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5mg/mL等不同浓度梯度。
②抗氧化效应检测：
依次向具塞试管中加入60μL1.0mM FeCl2溶液，90μL1.0mM 1,10-菲咯啉溶液，2.4mL 0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.8)，150μL 0.17M H2O2溶液及1.5mL不同浓度的生熟三七水提物溶液。充分摇匀后，于室温孵育5min，在560nm处用紫外分光光度计测定吸光度。
羟基自由基清除活性的计算公式如下：
清除率＝[1-(A1-A2)/A0]*100％；
A0代表无样品溶液的吸光度，作为空白对照；
A1代表加入不同浓度生熟三七水提物溶液后的吸光度；
A2代表无1,10-菲咯啉溶液时的吸光度。
③将不同生、熟三七水提物的活性成分Rh1、Rk3、Rh4和20(R)-Rg3的含量值带入公式II，计算它们的BCI抗氧化，将各样品的实测EC50与BCI抗氧化进行相关性分析，结果如表5所示，说明二者具有显著相关性，BCI抗氧化能更好地代表生、熟三七药材抗氧化效应，且能较准确地反映生、熟三七抗氧化效应存在较大差异性。
表5生、熟三七BCI抗氧化与实测抗氧化效应的相关性分析
三七抗凝血生化整合指数BCI抗凝血及抗氧化生化整合指数BCI抗氧化的具体应用：
根据以上实施例结果可以看出，生、熟三七药材的抗凝血生化指数BCI抗凝血及抗氧化生化整合指数BCI抗氧化均存在较大差异。总的说来，生三七抗凝血生化指数BCI抗凝血及实测抗凝血效应都优于熟三七，这从一定程度说明了生三七活血作用优于熟三七；而熟三七抗氧化生化整合指数BCI抗氧化和抗氧化效应均优于生三七，从一定程度说明熟三七保健养身、抗疲劳、抗衰老等补益作用优于生三七。而同一蒸制时间下的熟三七样品，其抗凝血生化指数BCI抗凝血及抗凝血作用随着蒸制温度的升高而逐渐降低，抗氧化生化指数BCI抗氧化及抗氧化作用随着蒸制温度的升高而逐渐升高；同一蒸制温度下的熟三七样品，其抗凝血生化指数BCI抗凝血及抗凝血作用随着蒸制时间的延长而逐渐降低，抗氧化生化指数BCI抗氧化及抗氧化作用随着蒸制时间的延长而逐渐升高，说明蒸制温度与时间是影响熟三七药效活性的重要因素，是炮制工艺中需要考察的关键条件。在临床应用中，需根据不同的用药需求选择不同的三七样品，BCI抗凝血值不小于0.45且BCI抗氧化值不大于0.10者的三七样品可能为生三七，更适宜用于活血功效；而BCI抗凝血值小于0.45且BCI抗氧化值大于0.10者的三七样品可能为熟三七，更适宜用于补益保健、抗氧化抗衰老等功效。此外，应用中应注意区别用量，对用于同一功效的同种制品而言，生化整合指数较低者应适当增加用药剂量；反之，指数较高者应适当减少用药剂量，以保证用药有效性的一致。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
一切从本发明的构思出发，不经过创造性劳动所作出的结构变换均落在本发明的保护范围之内。