1,8-萘二甲酰亚胺衍生物作基质在MALDI-MS中应用的制作方法

本发明涉及一种N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺及其类似物作为基质在基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)中的应用，属于质谱分析领域。

背景技术：

基质辅助激光解析离子化质谱自1988年Karas et al.和Tanaka et al.报道以来，因其快速、高准确性、高灵敏度等特点，受到广泛关注，目前已广泛应用到蛋白质、多肽、核苷酸、多糖、氨基酸等生物分子的分析过程中。

基质辅助激光解析离子化是一种软电离技术，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。可见基质在MALDI-MS的分析过程中发挥着至关重要的作用。从简单的有机基质到离子液基质，再到石墨烯、碳纳米管、多孔硅等无机基质，越来越多的物质被发现可以作为基质应用到MALDI-MS的分析过程中。然而分析物与基质间的作用机制并不清楚，新基质的发现往往是实验验证的结果。

1993年，Beavis and Bridson研究了芥子酸与染料标记的蛋白间的相互作用，观察到沙漏型的蛋白与基质掺杂的结晶，此后，基质α-腈基-4-羟基肉桂酸、2，5-二羟基苯甲酸均观察到这种与分析物的掺杂现象。这些研究中大多会应用标记的蛋白作为分析物，而这些标记试剂可能会影响分析物的性质，增加实验的复杂性。MALDI离子化根本上是分析物与基质之间的相互作用的结果，因此选用合适的不同结构的荧光试剂作为分析物研究与基质之间的相互作用对理解MALDI机理有重要作用，而且结构多样，价格低廉，操作简单。该发明所用基质N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺在405-600nm间均具有较强的荧光，可用于MALDI-MS的机理研究。

与常用的基质α-腈基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、2，5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、芥子酸(SA)、3-氨基喹啉(3-AQ)、2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)等类似，该发明所用基质N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺在355nm处有较强的紫外吸收，且可以与样品分子形成均匀的微晶固体，利于实验分析物的定量分析。且该发明样品用量少，重复性强，适用范围广，可在单次实验过程中同时分析小分子多肽等多种化合物，减少工作量，提高分析效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺及其类似物作为基质辅助激光解析离子化质谱基质的应用。N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺的结构式如式I所示：

本发明中所述N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺类似物包括以萘二甲酰亚胺为母核的所有天然及人工合成化合物。

本发明中所述基质辅助激光解析离子化质谱为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱和基质辅助激光解析离子化傅里叶变换离子回旋共振质谱，但也同样适用于其他质量分析器

本发明适合分析的样品包括单一化合物、结构相似的多种化合物的混合物、不同类型化合物的混合体系及与其他基质的混合体系。

本发明所述基质辅助激光解析离子化质谱的待测物包括小分子、多肽而不局限于此。

本发明中，基质溶液一般配置成0.5mg/ml至饱和，溶液原则上无特殊限制，一般为体积浓度30％-50％乙腈与含质量浓度0.1％-0.2％三氟乙酸的水或其他与之互溶的体系中的一种或二种以上。

本发明中所述方法进行MALDI-MS分析时，待测物与基质N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺的质量比原则上可使所有待测物离子化即可，一般为(1-10):(1-100)。

本发明中所述方法适用于Dried-Droplet、Thin-Layer、Sandwich等多种制备方法。其中Dried-Droplet法中，具体为质量比为(1-10):(1-100)的待测物与基质溶液混合均匀后，吸取0.5-1.0μL混合溶液与靶板上，待溶剂在空气中自然挥发干燥后，用于MALDI-MS分析。而Thin-Layer法中，基质与待测物的点样顺序无特殊限制，一般吸取0.5-1.0μL待测物溶液于干净的靶板上，待溶剂在空气中自然挥发干燥后，吸取质量比为(1-10):(1-100)的基质溶液0.5-1.0μL于样品点上，待溶剂再次在空气中自然挥发干燥后用于MALDI-MS分析。Sandwich法中，首先吸取0.5-1.0μL基质溶液于干净的靶板上，待溶剂在空气中自然挥发干燥后，吸取0.5-1.0μL待测物溶液于样品点上，待溶剂再次在空气中自然挥发干燥后，吸取0.5-1.0μL基质溶液于样片点上，再次置于空气中自然挥发干燥，后用于MALDI-MS分析。两次基质的合并用量原则上无限制，一般为与待测物的质量比为(1-10):(1-100)。

上述分析方法根据待测物的不同，既可以用于正离子扫描模式分析，也可以用于负离子扫描模式分析。

本发明应用于组织切片的质谱成像时，基质溶液均匀的喷洒于经干燥处理后的组织表面，后进行标准的质谱成像分析。

本发明基质用量少，使用范围广泛，离子化效率高，且结晶均匀，重复性强，利于待测物的定量分析。且在405-600nm间均具有较强的荧光，可取代标记蛋白进行MALDI-MS的机理研究，成本低廉，具有重要的实用价值。

N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺结晶形态均匀，可以应用到组织成像实验中，利于得到高分辨率的图像，并可在分析物的定量分析中发挥重要作用。更重要的是，N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺作为一种常用的罗丹明类荧光染料，可替代荧光标记蛋白，用于基质辅助激光解析离子化质谱的机理研究中。

附图说明

附图1为N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺的质谱分析图。

附图2为乙酰左旋肉碱盐酸盐的质谱分析图。

附图3为Aβ35-40的质谱分析图。

附图4为Aβ35-42的质谱分析图。

附图5为催产素的质谱分析图。

附图6为上述四种化合物的混合体系的质谱分析图。

附图7为基质2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)与N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺在双光子荧光显微镜下的分布图。7a、7c、7e分别为2,5-二羟基苯甲酸在双光子荧光显微镜下500-600nm通道的荧光发射图、N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺在双光子荧光显微镜下500-600nm通道的荧光发射图、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)与N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺Thin-Layer法共结晶后在500-600nm通道的荧光发射图。7b、7d、7f分别为2,5-二羟基苯甲酸、N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺和2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)与N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺Thin-Layer法共结晶后在双光子荧光显微镜下的白场图。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明做详细说明，实施例仅用于说明本发明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所用实验方法，如无特殊说明，均为标准实验方法；所用试剂及材料，如无特殊说明，均为商业获得；所用仪器为基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱仪5800(AB SCIEX)、双光子共聚焦显微镜系统FV1000MPE(Olympus)。

实施例1

称取1mg N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于1ml 50％乙腈和含0.2％三氟乙酸的水的混合溶液中，超声5分钟，离心后收集过膜的上清液备用。称取1mg乙酰左旋肉碱盐酸盐溶于1ml的甲醇中，超声5分钟得澄清的乙酰左旋肉碱盐酸盐溶液，取该溶液5μL溶于450μL甲醇中稀释至10μg/ml备用。取0.5μL N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液于干净的MALDI靶板上，置于空气中待溶剂自然挥发后进行MALDI-MS分析，结果如附图1所示。

N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液与10μg/ml的乙酰左旋肉碱盐酸盐溶液等体积混合后，取0.5μL混合溶液于干净的MALDI靶板上，置于空气中待溶剂自然挥发后进行MALDI-MS分析，结果如附图2所示。从图中可以看出，尽管N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺在小分子端有少量杂质，但并不影响小分子的分析，可以得到分辨率和信噪比均比较高的图谱。

实施例2

称取1mg N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于1ml 50％乙腈和含0.2％三氟乙酸的水的混合溶液中，超声5分钟，离心后收集过膜的上清液备用。500μgAβ35-40溶于500μl的甲醇中，超声5分钟得澄清的Aβ35-40溶液，取该溶液10μL溶于90μL甲醇中稀释至100μg/ml备用。

N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液与100μg/ml的Aβ35-40溶液等体积混合后，取0.5μL混合溶液于干净的MALDI靶板上，置于空气中待溶剂自然挥发后进行MALDI-MS分析，结果如附图3所示。从附图中可以看出，[M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M+2Na-H]⁺、[M+K+Na-H]⁺、[M+2K-H]⁺、[M+2K+Na-2H]⁺峰明显，分辨率和信噪比均较高。

实施例3

称取1mg N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于1ml 50％乙腈和含0.2％三氟乙酸的水的混合溶液中，超声5分钟，离心后收集过膜的上清液备用。500μgAβ35-42溶于500μl的甲醇中，超声5分钟得澄清的Aβ35-42溶液，取该溶液10μL溶于90μL甲醇中稀释至100μg/ml备用。

N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液与100μg/ml的Aβ35-42溶液等体积混合后，取0.5μL混合溶液于干净的MALDI靶板上，置于空气中待溶剂自然挥发后进行MALDI-MS分析，结果如附图4所示。从附图中可以看出，[M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M+2Na-H]⁺峰明显，分辨率和信噪比均较高。

实施例4

称取1mg N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于1ml 50％乙腈和含0.2％三氟乙酸的水的混合溶液中，超声5分钟，离心后收集过膜的上清液备用。称取1mg催产素溶于1ml甲醇中，超声5分钟得澄清的催产素溶液，取该溶液10μL溶于90μL甲醇中稀释至100μg/ml备用。

N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液与100μg/ml的催产素溶液等体积混合后，取0.5μL混合溶液于干净的MALDI靶板上，置于空气中待溶剂自然挥发后进行MALDI-MS分析，结果如附图5所示。从附图中可以看出，[M+Na]⁺、[M+K]⁺峰明显，分辨率和信噪比均较高。

实施例5

称取1mg N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶于1ml 50％乙腈和含0.2％三氟乙酸的水的混合溶液中，超声5分钟，离心后收集过膜的上清液备用。称取1mg催产素溶于1ml甲醇中，超声5分钟得澄清的1mg/ml的催产素溶液；称取1mg乙酰左旋肉碱盐酸盐溶于1ml的甲醇中，超声5分钟得澄清的1mg/ml的乙酰左旋肉碱盐酸盐溶液；500μgAβ35-40溶于500μl的甲醇中，超声5分钟得澄清的1mg/ml的Aβ35-40溶液；500μgAβ35-42溶于500μl的甲醇中，超声5分钟得澄清的1mg/ml的Aβ35-42溶液。分别取1mg/ml的催产素溶液、1mg/ml的Aβ35-40溶液、1mg/ml的Aβ35-42溶液各50μl，1mg/ml的乙酰左旋肉碱盐酸盐溶液5μl，甲醇345μl混合。

N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液与上述混合溶液等体积混合后，取0.5μL混合溶液于干净的MALDI靶板上，置于空气中待溶剂自然挥发后进行MALDI-MS分析，结果如附图6所示。从附图中可以看出，在单次检测过程中，乙酰左旋肉碱盐酸盐、Aβ35-40、Aβ35-42及催产素四种离子均可以检测，分辨率不受复杂混合体系的影响。同时采用该种方法可以减小激光损耗，基质用量，减小工作量，降低分析时间，提高分析效率。

实施例6

称取10mg2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)溶于1ml 50％乙腈和含0.2％三氟乙酸的水的混合溶液中，超声5分钟得澄清的10mg/ml的2,5-DHB溶液。用乙腈：水＝50:50的溶液配置N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液，浓度为0.5mM。

吸取0.5μL2,5-二羟基苯甲酸溶液于干净的玻片上，置于空气中自然挥发干燥，在500-600nm通道880V激光能量下测荧光发射，如图7a、7b。从图中可以看出500-600nm通道，2,5-二羟基苯甲酸几乎无荧光发射。吸取0.5μLN-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液于干净的玻片上，置于空气中待溶剂自然挥发，在500-600nm通道880V激光能量下测荧光发射，如图7c、7d。从图中可以看出，在500-600nm通道N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺有较强的荧光发射。吸取0.5μLN-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液于干净的玻片上，置于空气中待溶剂自然挥发，吸取0.5μL2,5-二羟基苯甲酸溶液于干燥的样品点上，再次置于空气中自然晾干，在500-600nm通道880V激光能量下测荧光发射，如图7e、7f。从图中可以看出，2,5-二羟基苯甲酸与N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺Thin-Layer法共结晶后，显示较强的荧光。基于研究者对基质与分析物相互作用的研究，推测可能为N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺掺杂进入2,5-二羟基苯甲酸的晶格，因此N-丁基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺作为一种荧光染料，可以用于MALDI离子化中分析物与基质相互作用的机理研究，具有重要的实用价值。