一种分析多黏菌素E甲磺酸钠组分的方法与流程

本发明属于药物分析领域，涉及一种分析多黏菌素E甲磺酸钠组分的方法。
背景技术：
：多黏菌素E是一类由多黏芽孢杆菌产生的抗革兰氏阴性菌的抗生素。为了降低其毒性，多黏菌素E经过化学修饰后合成为多黏菌素E甲磺酸钠(CMS)。临床上通常将CMS作为治疗严重多重耐药性细菌感染(如绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等)的最后一道防线药物。结构确证研究是药学研究的重要内容，是临床用药安全性的重要保障。CMS是包含有数十个成分的多组分混合物，其组分结构复杂性产生的原因主要有：1.修饰前的多黏菌素E主要包括E1、E2、E3、E1-I和E1-7MOA等，这些组分均含有5个氨基；2.在合成CMS时，每个氨基均可以产生两个磺基甲基化修饰，即双修饰。连接在氨基N原子上的甲磺酸钠基团是不稳定的，在后续工艺过程中会发生水解脱落，进而形成不同修饰程度的CMS产物；3.即使是修饰度相同的组分，也可能存在着修饰位置异构体。因此，在CMS药物开发中存在着对这些组分进行准确有效的分析、表征和控制的严峻挑战。对已公开的文献调研发现，直接分析CMS药物的复杂组分的HPLC法很少。CN200910174103.9中公开了一种反相高效液相色谱法分析多黏菌素E甲磺酸钠的方法，该方法中的流动相为三氟乙酸-水-乙腈体系，色谱柱为C4键合硅胶柱。该专利公开的图谱显示，其分析方法仅能分离多黏菌素E1甲磺酸钠和多黏菌素E2甲磺酸钠，不能有效分析不同磺基甲基化修饰程度的多黏菌素E1甲磺酸钠组分和(或)多黏菌素E2甲磺酸钠组分。技术实现要素：本发明提供一种分析多黏菌素E甲磺酸钠组分的方法，其特征在于，使用键合表面活性剂的硅胶柱作为固定相进行分析。在本发明的一些实施方案中，所述硅胶柱为Thermo公司的AcclaimTMSurfactant分析柱。在本发明的一些实施方案中，使用两种流动相进行梯度洗脱，其中流动相A选自磷酸盐、甲酸盐或乙酸盐缓冲液，流动相B选自乙腈。在本发明的一些实施方案中，其中流动相A为0.1mol/L磷酸二氢钠，pH6.5，流动相B为乙腈，按如下方式进行洗脱：在本发明的一些实施方案中，其中流动相A为0.5mol/L磷酸二氢钠，pH4.0，流动相B为乙腈，按如下方式进行洗脱：在本发明的一些实施方案中，其中流动相A为0.02mol/L乙酸铵，pH5.5，流动相B为乙腈，按如下方式进行洗脱：在本发明的一些实施方案中，其中流动相A为0.1mol/L甲酸铵，pH6.0，流动相B为乙腈，按如下方式进行洗脱：本发明提供的一种分析多黏菌素E甲磺酸钠组分的方法，能较大程度地分离不同修饰度的多黏菌素E1甲磺酸钠组分和(或)多黏菌素E2甲磺酸钠组分，可以用于CMS药物的分析研究和质量控制。附图说明图1：流动相为磷酸盐(pH6.5)时CMS、E1CMS和E2CMS的HPLC分析图。图2：流动相为磷酸盐(pH4)时CMS的HPLC分析图。图3：流动相为乙酸铵(pH5.5)时CMS、E1CMS和E2CMS的HPLC分析图。图4：流动相为甲酸铵(pH5.5)时CMS、E1CMS和E2CMS的HPLC分析图。具体实施方式以下实施例用于更好地理解本文所公开的主题，而不是以实施例方式加以限制。主要HPLC条件：色谱柱为Thermo公司的AcclaimTMSurfactant分析柱，尺寸为4.6×250mm，硅胶粒径5μm；柱温选择30℃；流速设置为1.0ml/min；检测波长设置为215nm。洗脱梯度依据使用的缓冲盐及pH的不同可做调整。样品为多黏菌素E甲磺酸钠(CMS)、多黏菌素E1甲磺酸钠(E1CMS)和多黏菌素E2甲磺酸钠(E2CMS)，用流动相A溶解。实施例1流动相A为0.1mol/L磷酸二氢钠，用氢氧化钠调节pH至6.5；流动相B为乙腈。用流动相A将CMS溶解成1mg/ml；用流动相A将E1CMS和E2CMS分别溶解成2mg/ml，进样后按照表1所示梯度洗脱。分析结果显示CMS样品在该条件下可洗脱出约30个色谱峰；E1CMS和E2CMS则分别可洗脱出约15个色谱峰，分别代表不同磺基甲基化修饰程度的组分。在该条件下保留相对较弱的一组为E2CMS，保留相对较强的为E1CMS，这两部分分离度较好，典型色谱图参见图1。表1：HPLC洗脱梯度实施例2流动相A为0.5mol/L磷酸二氢钠，用磷酸调节pH至4.0；流动相B为乙腈。用流动相A将CMS溶解成1mg/ml，进样后按照表2所示梯度洗脱。结果在该色谱条件下可洗脱出约40个色谱峰，表明该方法可实现CMS中组分的有效分析，典型色谱图参见图2。表2：HPLC洗脱梯度保留时间(min)％A％B0.0175.025.04.0075.025.035.0050.050.040.0050.050.042.0075.025.0实施例3流动相A为0.02mol/L乙酸铵，用乙酸调节pH至5.5；流动相B为乙腈。用流动相A将CMS溶解成1mg/ml，用流动相A分别将E1CMS和E2CMS溶解成2mg/ml，进样后按照表1所示梯度洗脱。结果显示CMS的洗脱峰约有15个，在该条件下保留相对较弱的一组为E2CMS，保留相对较强的为E1CMS，典型色谱图参见图3。实施例4流动相A为0.1mol/L甲酸铵，用甲酸调节pH至6.0；流动相B为乙腈。用流动相A将CMS溶解成1mg/ml；用流动相A分别将E1CMS和E2CMS溶解成2mg/ml，进样后按照表1所示梯度洗脱。结果显示CMS的洗脱峰约有25个，典型色谱图参见图4。当前第1页1 2 3