一种生防菌挥发性代谢物的检测方法与流程

文档序号:17455958发布日期:2019-04-20 03:17阅读:来源:国知局

技术特征:

1.β-倍半水芹烯在防治烟草真菌、细菌病害中的应用,其中,所述烟草真菌、细菌病害为烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌和炭疽病菌。

2.如权利要求1所述应用,其特征在于,β-倍半水芹烯是生防菌短小芽孢杆菌AR03的一种挥发性代谢产物,所述检测方法包括:

(1)生防菌培养:取培养基倾倒于无菌顶空瓶中冷却凝固,取生防菌发酵液涂布于培养基表面,加盖密封;同时设置空白对照组,所述空白对照组不添加生防菌发酵液;

(2)空白样品挥发物收集:将步骤(1)中获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置一定时间后,进行采样;采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶,将SPME针管刺入顶空瓶,推动手柄杆使纤维头伸出针管;萃取头置于顶空瓶的上部空间;收集完毕后将萃取头收起,并将针管拔出样品瓶,待GC-MS分析;

(3)细菌挥发物收集:将步骤(1)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置一定时间后,进行采样,采样前首先向顶空瓶侧壁注入1-十五烯内标溶液,注意尽量避免接触培养基基质,然后将SPME针管刺入顶空瓶,将萃取头置于顶空瓶上部空间,采集细菌挥发性代谢物,收集完毕后将萃取头收起,并将针管拔出样品瓶,待GC-MS分析;

(4)吸附正构烷烃C10-C20萃取头制作:将正构烷烃C10-C20溶液于顶空瓶中,在室温中静置一定时间后,进行采样;将SPME针管刺入顶空瓶,推动手柄杆使纤维头伸出针管;萃取头置于样品的上部空间,采集气态正构烷烃;收集完毕后将萃取头收起,并将针管拔出样品瓶,待GC-MS分析;

(5)挥发物定性分析:将步骤(2)、(3)获得含挥发物的探针以及步骤(4)吸附正构烷烃C10-C20的探针,在全扫描模式下进行分析,得到空白基质挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃C10-C20的总离子流图;

(6)细菌挥发性代谢物鉴定:将步骤(5)获得细菌挥发物总离子流图,扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰,即为挥发性代谢物特征指纹峰,经NIST和WILIY谱库对总离子图中化合物进行定性识别,对于识别的每种代谢物,根据其相邻正构烷烃的保留时间和碳原子数,计算该代谢物的保留指数,然后查阅NIST Chemistry WebBook中报道的该组分在相同色谱柱中的保留指数进行验证;

(7)细菌挥发代谢物定量分析:将步骤(2)、(3)和(4)中获得含挥发性有机物的探针,进GC-MS分析,根据步骤(6)获得的挥发性代谢物的鉴定结果,以1-十五烯溶液作为内标参照,采用内标法计算各色谱峰对应代谢物的相对含量;

所述GC-MS所采用的条件为:色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱,规格为30m×0.25mm×0.25μm;进样口:大体积进样口,冷不分流模式,初始温度40℃,以100℃/min速率升至250℃,解吸时间4min;载气为99.999%氦气,流速为1.0mL/min;柱温箱:初始温度40℃,保持2min,以5℃/min速率升至180℃,保持10min,以10℃速率升至280℃,保持15min,总运行时间为55min;EI离子源;全扫描模式,扫描范围30-400amu;

其中,生防菌短小芽孢杆菌AR03已于2010年8月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏编号为CGMCC No.4117。

3.如权利要求2所述应用,其特征在于,步骤(1)和步骤(2)中所述培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备方法为:葡萄糖15g,酵母粉1g,胰蛋白胨5g,牛肉浸膏3g,琼脂15-20g,加水定容至1000mL,调pH至7.0,121℃灭菌20min。

4.如权利要求2所述应用,其特征在于,所述1-十五烯溶液的浓度为2μg/mL,溶剂为甲醇。

5.如权利要求2所述应用,其特征在于,步骤(6)中进行定性识别时设置匹配度阈值为80。

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