一种用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物、试剂盒及其检测方法与流程

文档序号:12061425阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于阿胶及其复方制剂真伪鉴定的组合物,所述组合物由多肽I、多肽II、多肽III以及对照品检测基质组成,其特征在于:所述多肽I的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ala-Gly-Glu-Lys,多肽II的氨基酸序列为Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg,多肽III的氨基酸序列为Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg,对照品检测基质为鱼皮胶。

2.含有权利要求1所述组合物的检测试剂盒。

3.阿胶及其复方制剂真伪鉴定的方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)对照品溶液的制备:

称取对照品检测基质于量瓶中,加入NH4HCO3溶液,超声使样品完全溶解,加入称量好的多肽I、多肽II和多肽III,完全溶解,摇匀,微孔滤膜过滤,续滤液中加胰蛋白酶溶液,酶解;

2)待检测样品溶液的制备:

取待测样品,重量记为N1,加水溶解后,加入三氯乙酸溶液,超声,离心后去除上清液,沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重,重量记为N2;称取一定量沉淀干燥物于量瓶中,加入NH4HCO3溶液稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,续滤液中加入胰蛋白酶溶液,酶解;

3)液质联用仪检测

分别取对照品溶液、待检测样品溶液放入液质联用仪进行检测;选择m/z725.3→962.5、818.4,m/z386.4→499.3、643.3,m/z444.0→331.2、613.3作为检测离子对进行MRM扫描,其中选择m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2分别作为多肽I、多肽II和多肽III的定量离子对进行定量检测;

4)样品中驴皮源成分含量的计算

以对照品溶液的各多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制,各多肽的线性相关系数R≥0.998,由此计算出混合胶中多肽I、多肽II和多肽III的含量,待检测阿胶样品中多肽I的含量记为M1、多肽II的含量记为M2、多肽III的含量记为M3,然后,按下式计算出各样品中驴皮源成分的含量:

阿胶中驴皮源成分的含量(%)=(M1/1448.5–M2/770.8)×1772/M3×N2/N1

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤1)所述的对照品溶液的制备包括以下步骤:

1)基质溶液的制备:

称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中,加少量1%(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液,超声使样品完全溶解,用1%(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度,摇匀;

2)对照品母液的制备:

称取0.05g对照品检测基质于25ml量瓶中,加少量1%(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液,超声使样品完全溶解,分别加入28.3mg的多肽I、15.1mg的多肽II和17.3mg的多肽III,用1%(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度,摇匀;

3)对照品溶液的制备:

采用分步稀释的方法,以基质溶液为溶剂,将对照品母液稀释500~10000倍,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液100μl,加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl,37℃恒温酶解12h。

5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤2)所述的待检测样品溶液的制备包括以下步骤:取0.5-5g待测复方阿胶制剂样品,重量记为N1,加入水至总体积为4-5ml,混合后,加入30%(w/w)的三氯乙酸溶液5ml,超声15min,4℃静置30min,离心后去除清液,沉淀用丙酮洗涤、干燥后称重,重量记为N2,称取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中,加入少量1%(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液溶解后,用1%(w/w)pH8.0的NH4HCO3溶液稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl,37℃恒温酶解12h。

6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤5)中液质联用仪检测的液相条件为:C18反相色谱柱,流动相A为0.1%(v/v)甲酸的水溶液,流动相B为0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液,流速0.3ml/min;梯度洗脱:0→40min,流动相A 100%→50%,流动相B 0%→50%,质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测。

7.权利要求1所述的组合物在检测阿胶及其复方制剂中的阿胶含量中的应用。

8.权利要求2所述的试剂盒在检测阿胶及其复方制剂中的阿胶含量中的应用。

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