一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法。本发明属于医药检测技术领域。

背景技术：

狗骨为为犬科动物狗的骨骼，具有健脾和络、活血生肌的功效，主治风湿痹痛、腰腿无力、四肢麻木、久痢、疮瘘。以狗骨为主药制成的制剂有狗骨胶、狗骨胶药酒、复方狗骨胶、壮骨伸筋胶囊、驳骨丸等。目前狗骨的鉴别主要为性状鉴别和显微鉴别，因专属性不强，常存在鉴别不准确等情况，对于用狗骨加工后的产品无法鉴别，更无法定量检测。因为缺乏专属性鉴别方法和定量方法，部分不法厂家进行造假或掺假，以降低成本获得非法利润。

因此，目前迫切需要提出一种能够快速、准确检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法，进而实现对含狗骨源成分的产品的真伪鉴定。本发明从狗骨中主要成分出发，利用所含蛋白的氨基酸序列不同，找出狗骨特征性肽段，利用狗骨的特征肽段实现胶类中药及其复方制剂中狗骨源性成分含量的检测。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物。

本发明的另一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供一种能够快速、准确鉴定胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物，所述组合物由多肽及对照品检测基质组成，所述多肽的氨基酸序列为Gly-Glu-Pro-Gly-Val-Leu-Gly-Ala-Pro-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gly-Gly-Leu-Pro-Gly-Gl u-Arg(SEQ ID NO.1所示)，对照品检测基质为鱼骨胶。

含有所述组合物的检测试剂盒也在本发明的保护范围之内。

本发明进一步提供了一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的方法，具体包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备

1)基质溶液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀释至刻度；

2)对照品母液的制备：将称量好的对照品检测基质置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，将称量好的的多肽加入该量瓶中，用NH₄HCO₃溶液溶解并稀释至刻度；

3)对照品溶液制备：以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(2)待检测样品溶液的制备

将称量好的待测动物胶置于量瓶中，加NH₄HCO₃溶液，超声使动物胶完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，续滤液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(3)液质联用仪检测

分别取步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测样品溶液放入液质联用仪进行检测，选择m/z688.1→997.5、926.5、839.4作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z688.1→997.5作为多肽的定量离子对；

(4)样品中狗骨源成分含量的计算

以对照品溶液的多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，线性相关系数R≥0.9990，由此计算出样品中多肽的含量，然后，按下式计算出各样品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待测样品中多肽含量/待测样品的重量)÷(7.044×10^-3)×100％

优选的，步骤(1)及步骤(2)所述的酶解温度为37℃。

优选的，步骤(3)中液质联用仪检测的液相条件为：C₁₈反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：5→20min，流动相A 90％→75％，流动相B 10％→25％，质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测。

优选的，所述胶类中药为阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶、驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶或其他胶类中药。

再进一步的，本发明还提出了所述的组合物或所述的试剂盒在检测胶类中药及其复方制剂中的狗骨源成分含量中的应用。

直接对胶类中药中狗骨源成分进行准确的含量检测，首先要找出能标志狗骨源成分且在不同生产工艺的胶类中药中含量相对稳定的物质；其次胶类中药的成分非常复杂，检测时信号不稳定，因此该物质要满足在检测时具有较高的信号响应、较低的噪音及其他物质干扰，还应考虑检测信号的稳定性；第三需要设立合适的对照品等。

对此，本发明通过选取狗骨源特征性多肽，通过检测该多肽来判断是否含有狗源性成分，通过加入对照品检测基质来实现狗源性成分含量的精确检测。实验证明，采用本发明的方法，能够准确地检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分的含量，且操作简单，在胶类中药产品质量监控领域将具有广泛的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z688.1→997.5监测的质谱图；

图2是各种动物骨样品MRM扫描模式下选择离子对m/z688.1→997.5监测的质谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

1、材料和试剂

材料：各种胶类中药，包括狗骨胶、驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶、鱼骨胶(对照品检测基质)，分别用狗骨、驴骨、牛骨、猪骨、羊骨、鱼骨煎煮获得。

多肽交由生物公司合成。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)。

2、检测方法

(1)对照品溶液的制备

1)基质溶液的制备

称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀；

2)对照品母液的制备

称取0.05g对照品检测基质于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，称取40.2mg的多肽加入该量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；

3)对照品溶液的制备

采用分步稀释的方法，以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释1000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(2)待测样品溶液的制备

称取0.05g待测样品于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，继续加1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(3)液质联用仪检测

分别取步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测样品溶液各5μl放入液质联用仪进行检测，液相条件：C₁₈反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：5→20min，流动相A 90％→75％，流动相B 10％→25％。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z688.1→997.5、926.5、839.4作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z688.1→997.5作为多肽的定量离子对；

(4)样品中狗骨源成分含量的计算

图1是对照品溶液MRM扫描模式下选择离子对m/z688.1→997.5监测的质谱图；图2是各种动物骨样品MRM扫描模式下选择离子对m/z688.1→997.5监测的质谱图。

以对照品溶液的多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，线性相关系数R≥0.9990，由此计算出样品中多肽的含量，然后，按下式计算出各样品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待测样品中多肽含量/待测样品的重量)÷(7.044×10^-3)×100％。

其中，各样品中狗骨源成分的含量：

狗骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0.3484×10^-3g/0.0502g)÷(7.044×10^-3)×100％＝98.53％≈100％

驴骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0506g)÷(7.044×10^-3)×100％＝0％

牛骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0504g)÷(7.044×10^-3)×100％＝0％

猪骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0512g)÷(7.044×10^-3)×100％＝0％

羊骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0502g)÷(7.044×10^-3g)×100％＝0％

上述计算结果表明：狗骨胶中狗骨源成分的含量100％，驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶中狗骨源成分的含量为0％。这与实际情况相符，表明该方法能准确检测胶类中药中狗骨源成分的含量。

实施例2

1、材料和试剂

材料：各种纯品胶类中药，包括狗骨胶、驴骨胶、牛骨胶、猪骨胶、羊骨胶、鱼骨胶(对照品检测基质)，分别用狗骨、驴骨、牛骨、猪骨、羊骨、鱼骨煎煮获得。

多肽交由生物公司合成。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯)。

胶类中药复方制剂：向上述纯品骨胶中加入不同质量百分比的狗骨胶制成3个复方胶类中药制剂，包括含15％狗骨胶的牛骨胶、含30％狗骨胶的牛骨胶、含30％狗骨胶的猪骨胶，分别命名为制剂1、制剂2以及制剂3。

2、检测方法

(1)对照品溶液的制备

1)基质溶液的制备

称取0.50g对照品检测基质于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀；

2)对照品母液的制备

称取0.05g对照品检测基质于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解，称取40.2mg的多肽于该量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀释至刻度，摇匀；

3)对照品溶液的制备

采用分步稀释的方法，以步骤1)制得的基质溶液为溶剂，将步骤2)制得的对照品母液稀释500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(2)待测样品溶液的制备

取0.05g待测胶样品于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超声使样品完全溶解后，继续加1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h；

(3)液质联用仪检测

分别取步骤(1)制得的对照品溶液、步骤(2)制得的待检测样品溶液各5μl放入液质联用仪进行检测，液相条件：C₁₈反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脱：5→20min，流动相A 90％→75％，流动相B 10％→25％；质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z688.1→997.5、926.5、839.4作为检测离子对进行MRM扫描，其中选择m/z688.1→997.5作为多肽的定量离子对；

(4)样品中狗骨源成分含量的计算

以对照品溶液的多肽的含量为纵坐标、峰面积为横坐标进行标准曲线的绘制，线性相关系数R≥0.9990，由此计算出样品中多肽的含量，然后，按下式计算出各样品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待测样品中多肽含量/待测样品的重量)÷(7.044×10^-3)×100％。

其中，各样品中狗骨源成分的含量：

狗骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0.3562×10^-3g/0.0506g)÷(7.044×10^-3)×100％＝99.94％≈100％

含15％狗骨胶的牛骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0540×10^-3g/0.0502g)÷(7.044×10^-3)×100％＝15.27％

含30％狗骨胶的牛骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0.1104×10^-3g/0.0508g)÷(7.044×10^-3)×100％＝30.85％

含30％狗骨胶的猪骨胶中狗骨源成分的含量(％)＝(0.1082×10^-3g/0.0506g)÷(7.044×10^-3)×100％＝30.36％

上述计算结果表明：利用本发明的检测方法得到的制剂1-3中的狗骨源检测含量与实际情况相符，表明该方法能准确检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分的含量。

综上所述，利用本发明公开的多肽以及对照品检测基质，采用液质联用仪，能准确检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分的含量。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

序列表

<110> 东阿阿胶股份有限公司

<120>一种用于检测胶类中药及其复方制剂中狗骨源成分含量的组合物、试剂盒及其检测方法

<130> KLPI161250

<160> 1

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 多肽

<400> 1

GlyGluProGlyValLeuGlyAlaProGlyThrAlaGlyAlaSerGlyProGlyGlyLeuProGlyGluArg 24