一种流式细胞仪及其三维视频监测装置的制作方法

本发明涉及流式细胞监测装置技术领域，具体涉及一种流式细胞仪及其三维视频监测装置。

背景技术：

流式细胞仪(Flow Cytometer，简称FCM)是现在显微镜技术、化学荧光染色、电子学技术和计算机等领域的综合进步的结合下得以发展起来的对于快速直线流动中的单细胞的特性及其成分，或其他各种微小颗粒(如细菌)及其负载物进行多参数分析和分选的高新仪器，它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的形状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA以及RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析。商业流式细胞仪主要包括光学系统、电子检测系统与流动室。

其中流动室是整个仪器最核心的检测载体，一般为方形或者圆形的长而直的毛细管道。在该管道中，所有被检测的颗粒及其所在样品液，均要在二维流体聚焦力(hydrodynamic focusing)的作用下，紧密的束缚在管道中间形成单个颗粒依次通过的柱状超细层流，其截面直径或长(宽)通常在10μm左右。细胞、微球等颗粒因此与样品液一同被束缚在该柱状流中，并被激光器(其光斑大小通常为20μm-80μm)在固定的位置所激发，进而被散射光和荧光检测系统所检测和识别。

由于二维流体聚焦所形成的柱状样品流很细小，常规机械加工与制备工艺会引入一定的误差(>50μm)，这些误差导致不同批次生产、不同人员安装出来的流动室中聚焦样品流的位置、稳定程度存在一致性差异，并无法在毛细管道内呈现均匀、清晰的流体分布，为仪器其他系统的装配与调试过程提出了一定的考验。当前图像采集装置为单轴，并导致监测信息利用不充分，且识别效果差等技术问题。

技术实现要素：

针对上述现有技术的问题，本发明目的在于提供一种流式细胞仪及其三维视频监测装置，解决现有技术其流动室样品流存在不稳定聚焦并无法在毛细管道内呈现均匀、清晰的流体分布，其图像采集装置为单轴无法提供柱状流的三维空间位置等技术问题。

本发明提供了一套双轴正交的视频监测系统，从两个空间方向上对样品流聚焦情况进行拍摄，并通过软件自动判断其相对位置、宽度和长期稳定性，本文也提出了一套相应的流动室聚焦效果的测试与调试方法，以达到所有流动室中样品流均稳定地聚焦在毛细管道轴心的目的。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于流式细胞仪的流动室，包括毛细管道和具有倒锥体结构的聚焦腔室，聚焦腔室的锥部连接毛细管道，连接处作为样品液的毛细管道注入口；所述聚焦腔室还通有鞘液，鞘液通过所述聚焦腔室的内壁在所述毛细管道注入口处与样品液聚焦、包裹形成柱状流。

上述方案中，所述聚焦腔室的侧部或顶部平面设置有鞘液导入口和样品液导入口。

上述方案中，所述鞘液导入口,其数量至少包括两个；所述样品液导入口，设置在聚焦腔室的倒锥体中轴线上，并设置一位置可调整的样品针通过所述样品液导入口导入所述样品液。

一种用于流式细胞仪的监测装置，包括

毛细管道，通有一包含样品液的柱状流；

第一光源，照射毛细管道，并致使柱状流散射光线；

第一图像采集装置，接收毛细管道内柱状流的后向散射光或侧向散射光；

第二图像采集装置，对应第一图像采集装置所接收的后向散射光或侧向散射光，接收剩余的侧向散射光或后向散射光。

上述方案中，所述的第二图像采集装置，或者接收前向散射光。

上述方案中，还包括第二光源，与所述的第一光源、第一图像采集装置和第二图像采集装置在相对于毛细管道内柱状流流向所垂直的平面上对应光发射所致散射和散射光接收关系异面地或共面地呈十字形安装结构或X字母形安装结构，十字形安装结构或X字母形安装结构的中心在毛细管道中轴线上。

上述方案中，所述第二光源，通过第一光源反射、折射或分束设置得到，或者选用互补频谱或有重叠频谱的光源。

一种流式细胞仪组件，包括

流动室，包括毛细管道和具有倒锥体结构的聚焦腔室，向其导入样品液和至少两处导入鞘液并通过聚焦腔室内壁将鞘液在毛细管道注入口处与样品液聚焦、包裹形成柱状流；

监测装置，包括第一光源、第二光源、第一图像采集装置和第二图像采集装置；

所述的第一光源、第二光源、第一图像采集装置和第二图像采集装置，在相对于毛细管道内柱状流流向所垂直的平面上对应光发射所致毛细管道散射和散射光接收的位置关系异面地或共面地呈十字形安装结构或X字母形安装结构，十字形安装结构或X字母形安装结构的中心在毛细管道中轴线上。

上述方案中，所述的毛细管道选用高透明、无自发荧光、耐酸碱的材料；所述毛细管道的形状为笔直长管道，其内截面为方形或者长方形，外截面对应内截面为方形或者长方形。

上述方案中，所述的第一图像采集装置和第二图像采集装置，均包括拍摄相机、与拍摄相机匹配的收集镜头，拍摄相机装配收集镜头并分别安装于一个三维调整架；所述的第一光源与第一图像采集装置对准并构成第一轴监测结构，所述的第二光源与第二图像采集装置对准并构成第二轴监测结构，第一轴监测结构和第二轴监测结构的中轴位置关系为正交。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1.两个鞘液从腔室顶部或者侧壁直接导入，在样品针周围形成环绕，并在出射的样品流周围形成二维流体聚焦动力，在聚焦腔室锥部壁内，像剑鞘一样将其样品流包裹成柱状流，柱状流平滑进入毛细管管道，并保持其原有的聚焦结构，实现了毛线管道内稳定的细胞流体并且在沿毛线管道内柱状流流向的纵向截面上形成了清晰、容易区分的鞘流-样品流-鞘流的流体分布；

2.每组光源和聚光镜、收集镜头和拍摄相机共轴相对放置，光源和聚光镜发出的光源穿过毛细管，照亮其核心区域，并穿过收集镜头汇聚到拍摄相机成像面，两组照明和拍摄系统高度处于同一水平面上，并以90°正交的方式占据四个方位，形成对毛细管道的双视角立体观察；

3.本发明通过双视角立体监测结构，还能实现检测效果互相补偿，90°正交位置关系的监测结构能恰好互相符合侧向散射接收要求，即第一光源对毛细管道的后向散射由第一图像采集装置接收并且其侧向散射将补偿第二图像采集装置的采集结果，第二光源对毛细管道的后向散射由第二图像采集装置接收并且其侧向散射将补偿第一图像采集装置的采集结果，巧妙地实现了额外的效果增强；

4.本发明在安装时可以反馈地为对准位置作出微小调整以确保实现双向偏心距最小，即保持流动室安装后各样品流位置的一致性，对毛细管道中聚焦所成一条圆柱状的液流柱宽度、相对位置的进行了自动检测，也能对流动室二维流体动力聚焦效果作出判断、监测评价，提高生产流动室的良品率。

附图说明

图1为本发明的流式细胞仪示意图，1为流动室的聚焦腔室，2L、2R为位于聚焦腔室侧面的鞘液导入口，3为样品液导入口，4为毛细管道；

图2为本发明(左)流动室安装关系、(中)聚焦样品流与毛细管道的位置关系、(右)毛细管道横截面的示意图；

图3为本发明三维视频监测结构俯视图；

图4为本发明三维视频监测软件分析系统示例图，(左上)为第一图像采集装置所得图像的识别结果、(右上)为第二图像采集装置所得图像的识别结果、(左下)为聚焦空间位置的识别结果、(右下)为各参数计算数值；

图5为本发明视频分析数据统计示例图；

图6为流动室安装调配流程图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

下面结合附图对本发明做进一步说明：

实施例

本发明提供了一种用于流动室装配的三维视频监测装置及其识别方法，可完成对毛细管道中聚焦成一条圆柱状的液流柱宽度、相对位置的自动检测，该装置主要用于流式细胞仪核心组件，即流动室的二维流体动力聚焦效果的判断、监测评价，并为其安装时位置的微小调整提供参考依据。

整个监测系统包括两套光源、聚焦镜、收集镜头、拍摄相机和三维调整架，其中光源和聚光镜组合配套使用，用于形成直径略大于毛细管道外径的准直光斑，并照亮其管道中央部分；收集镜头和拍摄相机配套使用，用于对毛细管的管道中的液流情况进行成像记录，其视场略大于毛细管道的内径；收集镜头和拍摄相机拧紧装配后安装在三维调整架上，用于视频检测的空间位置调整。

如图3，每组光源和聚光镜、收集镜头和拍摄相机共轴相对放置，光源和聚光镜发出的光源穿过毛细管，照亮其核心区域，并穿过收集镜头汇聚到拍摄相机成像面。两组照明和拍摄系统高度处于同一水平面上，并以90°正交的方式占据四个方位，形成对毛细管道的双视角立体观察。三维调整架用于实施照明光路和收集光路的对准，并提供上下调节的自由度，用于实现对毛细管道不同高度位置的追踪监测。

如图2，本发明中核心观察与检测对象为毛细管内管道及其流体，更具体为在毛细管道中聚焦成一条细柱状流的样品流，以及其相对于毛细管道内壁的空间位置。该毛细管道优先由玻璃、石英等高透明、无自发荧光、耐酸耐碱等材料构成，毛细管道为笔直长管道，其内截面可以为方形或者长方形，外截面可以为相应的方形或者长方形。

如图1，该毛细管道入口安装到聚焦腔室出口上，上下整体构成流动室。聚焦腔室为倒锥体结构，除了在锥顶的该出口外，在顶部平面还有三个入口，包括两个鞘液入口、一个样品液入口。其中样品液由样品针导入，其针尖伸出延长到聚焦腔室中间位置，该样品针应位于聚焦腔室的轴心。两个鞘液从腔室顶部平面或者侧壁直接导入，在样品针周围形成环绕，并在出射的样品流周围形成二维流体聚焦动力。在聚焦腔室锥部出口，像剑鞘一样将其样品流包裹成柱状流。最后，这些流体平滑进入毛细管管道，并保持其原有的聚焦结构。

在所述特征中，样品柱状流相对毛细管道壁的位置，取决于样品针的安装角度和位置，本视频监测的结果可为其微小调整提供依据。

所述视频监测是指双轴相机拍摄到毛细管管道内流体的状态，并由软件识别系统自动识别出对应信息，实时定量给出判读结果、并记录的过程。对每一套成像系统而言，所述软件识别包括：成像质量是否清晰，毛细管管道是否在视频中，毛细管内壁左右边界的识别，样品流左右边界的识别。通过这四条边界的识别和位置记录，可计算得到样品流宽度、聚焦液流柱的中心位置距离毛细管左右内壁的距离，样品流中心线和毛细管内壁中心的偏心距等信息。将正交的双视频汇总，得到横向多参数，侧向多参数的信息，画出聚焦样品流在毛细管道横截面上的二维坐标测绘图，如图4所示。用于评价流动室的工作状态是否正常，并通过调整样品针的位置，得到双向偏心距最小的目的。

这些数据还可进行最大值、最小值、平均值、标准偏差，变异系数等单参数的统计学分析，也可以进行前向与侧向比例的关联性分析。通过该视频监测装置，还可长时间记录流动聚焦的相对位置、宽度等参数信息，进行鞘流稳定时间、宽度变化幅度、位置变化幅度等指标的评价，如图5所示。对各个装配好的流式室进行稳定性评价，帮助提高出厂产品的良品率。

所示特征中，收集镜头，包括多个凸透镜，且用于将毛细管内壁边缘和内壁中运动流体在产生的像放大为适合拍摄相机感光面大小的实像。所述收集镜头包括可以包括第一凸镜、第二凸镜和第三凸镜，第二凸镜位于第一凸镜和第三凸镜之间，所述凸镜可以为石英玻璃。

本发明所述的，收集镜头及相机调整架具备三维调整自由度，首先可分别在水平面二维调整以使得照明和成像部分共轴，其次还可同时在高度方向上进行调整，对毛细管道不同高度进行检测，得到不同高度位置处的二维信息测绘图。

本发明所述的，流动室还可绕毛细管轴心进行转动，对不同视角情况下样品流聚焦特性的检测。在每个角度下由正交双检测系统记录两组数值，通过180°旋转加自动识别描绘，可以得到样品流360°度的真实聚焦情况。

具体实施方式中，毛细管可采用内径200μm外径8mm的方形石英玻璃，视频采集相机可采用640*480像素的1/2英寸的CCD相机，收集镜头可采用17X长焦镜头，整体的空间分辨率为0.925μm，采集频率为60fps。

一种实施例中，流动室的装配流程可以如下：

S1：对流动室部件进行预装配，并连接上外部管路，用0.1M氢氧化钠溶液、清洗液交替清洗两次流动室，去除残留杂质；

S2：鞘液管道通入鞘液，样品管道通入校准溶液，在测试进样比例下，形成柱状鞘流。在本三维监测系统上进行分析；

S3：由视频软件分析，得到样品流在前向与侧向的偏心距；对进样针两轴位置进行微调，直至两个方向偏心距为零；

S4：分析样品流，得到前向与侧向的宽度，并与标准值比对；长期连续监测样品流的宽度与偏心距信息，得到稳定性评价；

所述校准溶液可以为各类高吸光、有色溶液，包含但不限于甲基蓝、亚甲基蓝、洋红、罗丹明、结晶紫等溶液。

另外，需要说明的是，光源、聚焦镜、收集镜头及相机的参数比较灵活，本领域人员可以根据实际选定，非本发明的关键参数。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。