一种大麻愈伤组织的石蜡切片制作方法与流程

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种大麻愈伤组织石蜡切片的制作方法。

背景技术：

大麻（Cannabis Sativa L.）是一种环境适应性优良、吸附重金属能力强的天然纤维植物，在纺织、制药、建材、能源等领域发挥着不容低估的作用并具有广阔的发展前景（熊和平，2008）。大麻纤维具有拉伸度高、保形性好、吸湿性好、抗菌和抗静电能力强等优点，随着全球石油、煤炭等重要自然资源日益枯竭，大麻作为一种重要的天然纤维植物，将发挥越来越重要的作用。我国的纤用大麻种植面积和均产量居世界前列。

大麻是一种常雌雄异株且常异花授粉的作物，遗传背景复杂，使用传统育种方法进行品种改良进程十分缓慢，随着生物技术的发展，转基因方法进行品种改良成为一种高效、目的性强的育种手段，高效转基因体系建立的前提是高效再生体系的建立，而且，植物再生方式有体细胞胚胎发生和体细胞器官再生等多种方式，不同再生方式对转基因效率影响重大，因此，研究大麻的再生体系及其再生方式，将为大麻转基因研究提供理论基础和技术支持。对大麻再生过程产生的愈伤组织进行石蜡切片，是研究其再生方式的一种便捷方法。

石蜡切片制作程序包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片染色等步骤，涉及到的程序和环节繁多，周期长。根据组织材料特性不同，所用的试剂、浓度、时间也各不相同。至今为止没有专门应用于制备大麻组织植物切片的技术，一般情况下每一块固定的组织制作20-40个切片，每个片子需要逐一染色，耗时耗力，造成使用常规的石蜡切片技术效率不高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，根据大麻愈伤组织幼嫩等特点，提供一种操作流程较简单，特别适于大麻的大麻愈伤组织的石蜡切片制作方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种大麻愈伤组织的石蜡切片制作方法，包括以下步骤：

一、取材与固定：

（1）选取合适发育时期的大麻愈伤组织材料，流水冲洗，去掉培养基等杂物；

（2）用滤纸吸去大麻愈伤组织表面的水份；

将大麻愈伤组织材料浸入改良后的FAA固定液中，固定24h以上；为使固定液更好地渗透到大麻愈伤组织中，将固定后的材料置于抽气装置中抽气1小时以上；

因大麻愈伤组织材料幼嫩，为防止材料收缩，将FAA固定液进行了改良，本发明改良后的FAA固定液为：质量浓度为38-40%的甲醛溶液（福尔马林）、冰醋酸和体积浓度为50-65%的乙醇溶液以体积比为1：1：18-20混合；

二、整体染色：

（1）用体积浓度为70-75%的酒精洗涤经步骤1处理的大麻愈伤组织材料（优选洗涤3-5次）；（目的是洗去表面残留的固定液和杂质）；

（2）将大麻愈伤组织材料用埃氏苏木精染色液染色 7-15天，为使染色液更好地渗透到大麻愈伤组织中，将染色后的大麻愈伤组织材料置于抽气装置中抽气1小时后，然后分别用体积浓度为75%、50%、30%、10%的乙醇依次浸泡0.5-0.8h（洗涤），流水冲洗过夜；

所述埃氏苏木精染色液配方为苏木精2g，冰醋酸10ml，甘油100ml，体积浓度为95%的酒精100ml，蒸馏水100ml，硫酸铝钾5g；配置流程参见王灶安等，植物显微技术，农业出版社，1989；

（3）将大麻愈伤组织材料在质量浓度为0.04-0.06%的氨水溶液（PH 8-9）中浸泡30-35min，进行分色复蓝（使细胞核仁和染色质呈现蓝黑色，其余浅蓝色），再用流水冲洗10-30min；

三、脱水：用不同浓度的乙醇溶液进行梯度（体积浓度分别为30%、50%、70%、80%、90%、100%）脱水，每次40min-1h；

使用体积浓度为70%的乙醇溶液脱水时，可将大麻愈伤组织材料在70%乙醇溶液中浸泡过夜，再进行更高浓度乙醇脱水。

浸泡大麻愈伤组织材料所用的乙醇溶液的体积为V。

四、透明：

（1）用100%的乙醇对大麻愈伤组织材料脱水后，倒去V*1/2浸泡大麻的乙醇溶液，加入V*1/2体积的二甲苯, 浸泡时间0.5-1h;

（2）再次倒去V*1/2体积的原液，加入V*1/2体积的二甲苯, 浸泡时间0.5-1h;

（3）倒去全部原液，加入二甲苯，浸泡0.5-1h；（也可再倒去全部二甲苯，再加入二甲苯，浸泡0.5-1h）；

五、浸蜡与包埋：

（1）将透明处理后的大麻愈伤组织材料连瓶放入恒温箱中，倒去1/2体积二甲苯，加入蜡屑（石蜡切成的碎屑，熔点为52-54℃和62-64℃的蜡屑按体积比1：1混合）直到溶液饱和，48-50℃保温1-1.2h;

（2）倒去1/2原介质，加1/2纯蜡（熔点为58-62℃）（所加纯蜡的体积与倒去的原介质的体积相同），58-62℃保温1h；重复操作两次；

（3）将步骤（2）原介质倒去，加入纯蜡；倒去纯蜡，再次加入新的纯蜡，于58-62℃恒温箱过夜，用常规石蜡进行包埋；

六、切片、展片及粘片：

（1）根据材料在蜡块中的位置和方向，修裁蜡块成梯形，粘到旋转式手动切片机的蜡台上进行切片，切片厚度7-10μm，得蜡带。

（2）在洁净的载玻片上均匀涂上明胶溶液（所述明胶溶液为1g明胶溶于100ml蒸馏水制成的溶液），将蜡带平放明胶溶液上，以水作漂浮剂，在50－52℃恒温铁板上使蜡带展平后，于65－66℃烤片3－3.2h；

七、脱蜡：将经步骤（六）处理的切片放入二甲苯中浸泡脱蜡2-5h；

八、封片、观察：将经步骤（七）处理的切片从二甲苯中取出后，在二甲苯完全挥发前，在载玻片中央滴1滴中性树胶，将盖玻片从一侧慢慢放下并将空气排除，将封好的切片放入38-42℃恒温箱干燥过夜，即成为永久切片。

本发明根据大麻愈伤组织的特点，对常规石蜡切片技术进行修改，是一种适合大麻愈伤组织石蜡切片的高效方法。

本发明对现有植物切片技术进行了改进，根据大麻愈伤组织幼嫩、易碎等特点，修改了FAA固定液的成分（降低了原配方中的酒精浓度，有效防止幼嫩材料皱缩）。增加了固定后和染色前的抽气步骤（使固定液或染色液能更有效地浸入愈伤组织中间部位）。用固定后即进行整体染色的方法，用稀氨水使之快速复蓝，与其他染色方法如切片后染色，或先整体染色再在切片后复染相比（参见康海岐，常红叶，许育彬，陈 放，水稻籽粒胚乳的石蜡切片方法改良及其结构发育观察，西北植物学报 , 2008 , 28 ( 5 ) : 1069 -1074），本发明删减了切片后染色的步骤。本方法能够得到组织结构完整、清晰的大麻愈伤组织石蜡切片，用本方法制作大麻愈伤组织石蜡切片比现有植物石蜡切片技术更适合、效率更高。

附图说明

图1是本发明实施例1的大麻愈伤组织切片的显微照片；

图2是本发明实施例2的大麻愈伤组织切片的显微照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本实施例之大麻愈伤组织的石蜡切片制作方法，包括以下步骤：

1、取材与固定：

（1）选取培养5d后的大麻愈伤组织材料，流水冲洗，去掉培养基等杂物；

（2）用滤纸吸去大麻愈伤组织表面的水份；

将大麻愈伤组织材料浸入改良后的FAA固定液中，固定24h；为使固定液更好地渗透到大麻愈伤组织中，将固定后的材料置于抽气装置中抽气1小时；

因大麻愈伤组织材料幼嫩，为防止材料收缩，将FAA固定液进行了改良，本发明改良后的FAA固定液为：质量浓度为38%的甲醛溶液（福尔马林）、冰醋酸和体积浓度为50%的乙醇溶液以体积比为1：1：18混合；

2、整体染色：

（1）用体积浓度为70%的酒精洗涤经步骤1处理的大麻愈伤组织材料（洗涤3次）；（目的是洗去表面残留的固定液和杂质）；

（2）将大麻愈伤组织材料用埃氏苏木精染色液染色 7天，为使染色液更好地渗透到大麻愈伤组织中，将染色后的大麻愈伤组织材料置于抽气装置中抽气1小时后，然后分别用体积浓度为75%、50%、30%、10%的乙醇依次浸泡0.5h（洗涤），流水冲洗过夜；

所述埃氏苏木精染色液配方为苏木精2g，冰醋酸10ml，甘油100ml，体积浓度为95%的酒精100ml，蒸馏水100ml，硫酸铝钾5g；配置流程参见王灶安等，植物显微技术，农业出版社，1989；

（3）将大麻愈伤组织材料在质量浓度为0.04%的氨水溶液（PH 8-9）中浸泡30min，进行分色复蓝（使细胞核仁和染色质呈现蓝黑色，其余浅蓝色），再用流水冲洗10min；

3、脱水：用不同浓度的乙醇溶液进行梯度（体积浓度分别为30%、50%、70%、80%、90%、100%）脱水，每次40minh；

使用体积浓度为70%的乙醇溶液脱水时，将大麻愈伤组织材料在70%乙醇溶液中浸泡过夜，再进行更高浓度乙醇脱水。

浸泡大麻愈伤组织材料所用的乙醇溶液的体积为V。

4、透明：

（1）用100%的乙醇对大麻愈伤组织材料脱水后，倒去V*1/2浸泡大麻的乙醇溶液，加入V*1/2体积的二甲苯, 浸泡时间0.5h;

（2） 再次倒去V*1/2体积的原液，加入V*1/2体积的二甲苯, 浸泡时间0.5h;

（3）倒去全部原液，加入二甲苯，浸泡0.5h；再倒去全部二甲苯，再加入二甲苯，浸泡0.5h；

5、浸蜡与包埋：

（1）将透明处理后的大麻愈伤组织材料连瓶放入恒温箱中，倒去1/2体积二甲苯，加入蜡屑（石蜡切成的碎屑，熔点为52-54℃和62-64℃的蜡屑按体积比1：1混合）直到溶液饱和，48℃保温1h;

（2）倒去1/2原介质，加1/2纯蜡（熔点为58-62℃）（所加纯蜡的体积与倒去的原介质的体积相同），58℃保温1h，重复两次。

（3）将步骤（2）原介质倒去，加入纯蜡；倒去纯蜡，再次加入新的纯蜡，于60℃恒温箱过夜，用常规石蜡进行包埋；

6、切片、展片及粘片：

（1）根据材料在蜡块中的位置和方向，修裁蜡块成梯形，粘到旋转式手动切片机的蜡台上进行切片，切片厚度7-10μm，得蜡带。

（2）在洁净的载玻片上均匀涂上明胶溶液（所述明胶溶液为1g明胶溶于100ml蒸馏水制成的溶液），将蜡带平放明胶溶液上，以水作漂浮剂，在50－52℃恒温铁板上使蜡带展平后，于65℃烤片3h；

7、脱蜡：将经步骤（6）处理的切片放入二甲苯中浸泡脱蜡2h；

8、封片、观察：将经步骤（7）处理的切片从二甲苯中取出后，在二甲苯完全挥发前，在载玻片中央滴1滴中性树胶，将盖玻片从一侧慢慢放下并将空气排除，将封好的切片放入40℃恒温箱干燥过夜，即成为永久切片。

图1是本发明实施例1的大麻愈伤组织切片；可见本方法能够得到组织结构完整、清晰的大麻愈伤组织石蜡切片，用本方法制作大麻愈伤组织石蜡切片比现有植物石蜡切片技术更适合、效率更高。

实施例2

本实施例之大麻愈伤组织的石蜡切片制作方法，包括以下步骤：

1、取材与固定：

（1）选取培养9d后的大麻愈伤组织材料，流水冲洗，去掉培养基等杂物；

（2）用滤纸吸去大麻愈伤组织表面的水份；

将大麻愈伤组织材料浸入改良后的FAA固定液中，固定24h；为使固定液更好地渗透到大麻愈伤组织中，将固定后的材料置于抽气装置中抽气1小时；

因大麻愈伤组织材料幼嫩，为防止材料收缩，将FAA固定液进行了改良，本发明改良后的FAA固定液为：质量浓度为40%的甲醛溶液（福尔马林）、冰醋酸和体积浓度为65%的乙醇溶液以体积比为1：1：20混合；

2、整体染色：

（1）用体积浓度为75%的酒精洗涤经步骤1处理的大麻愈伤组织材料（洗涤5次）；（目的是洗去表面残留的固定液和杂质）；

（2）将大麻愈伤组织材料用埃氏苏木精染色液染色15天，为使染色液更好地渗透到大麻愈伤组织中，将染色后的大麻愈伤组织材料置于抽气装置中抽气1小时后，然后分别用体积浓度为75%、50%、30%、10%的乙醇依次浸泡0.8h（洗涤），流水冲洗过夜；

所述埃氏苏木精染色液配方为苏木精2g，冰醋酸10ml，甘油100ml，体积浓度为95%的酒精100ml，蒸馏水100ml，硫酸铝钾5g；配置流程参见王灶安等，植物显微技术，农业出版社，1989；

（3）将大麻愈伤组织材料在质量浓度为0.06%的氨水溶液（PH 8-9）中浸泡35min，进行分色复蓝（使细胞核仁和染色质呈现蓝黑色，其余浅蓝色），再用流水冲洗10-30min；

3、脱水：用不同浓度的乙醇溶液进行梯度（体积浓度分别为30%、50%、70%、80%、90%、100%）脱水，每次40min-1h；

使用体积浓度为70%的乙醇溶液脱水时，将大麻愈伤组织材料在70%乙醇溶液中浸泡过夜，再进行更高浓度乙醇脱水。

浸泡大麻愈伤组织材料所用的乙醇溶液的体积为V。

4、透明：

（1）用100%的乙醇对大麻愈伤组织材料脱水后，倒去V*1/2浸泡大麻的乙醇溶液，加入V*1/2体积的二甲苯, 浸泡时间1h;

（2）再次倒去V*1/2体积的原液，加入V*1/2体积的二甲苯, 浸泡时间1h;

（3）倒去全部原液，加入二甲苯，浸泡1h；再倒去全部二甲苯，再加入二甲苯，浸泡1h；

5、浸蜡与包埋：

（1）将透明处理后的大麻愈伤组织材料连瓶放入恒温箱中，倒去1/2体积二甲苯，加入蜡屑（石蜡切成的碎屑，熔点为52-54℃和62-64℃的蜡屑按体积比1：1混合）直到溶液饱和，50℃保温1.2h;

（2）倒去1/2原介质，加1/2纯蜡（熔点为58-62℃）（所加纯蜡的体积与倒去的原介质的体积相同），62℃保温1h，重复两次。

（3）将步骤（2）原介质倒去，加入纯蜡；倒去纯蜡，再次加入新的纯蜡，于62℃恒温箱过夜，用常规石蜡进行包埋；

6、切片、展片及粘片：

（1）根据材料在蜡块中的位置和方向，修裁蜡块成梯形，粘到旋转式手动切片机的蜡台上进行切片，切片厚度7-10μm，得蜡带。

（2）在洁净的载玻片上均匀涂上明胶溶液（所述明胶溶液为1g明胶溶于100ml蒸馏水制成的溶液），将蜡带平放明胶溶液上，以水作漂浮剂，在52℃恒温铁板上使蜡带展平后，于66℃烤片3.2h；

7、脱蜡：将经步骤（6）处理的切片放入二甲苯中浸泡脱蜡5h；

8、封片、观察：将经步骤（7）处理的切片从二甲苯中取出后，在二甲苯完全挥发前，在载玻片中央滴1滴中性树胶，将盖玻片从一侧慢慢放下并将空气排除，将封好的切片放入40℃恒温箱干燥过夜，即成为永久切片。

图2是本发明实施例2的大麻愈伤组织切片；可见本方法能够得到组织结构完整、清晰的大麻愈伤组织石蜡切片，用本方法制作大麻愈伤组织石蜡切片比现有植物石蜡切片技术更适合、效率更高。