本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及用于检测Sf弹状病毒(Sf-rhabdovirus)N蛋白残留的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。
背景技术：
：昆虫细胞/杆状病毒表达系统具有安全性高，对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点，已经广泛应用于重组蛋白的表达和研究中。国外公司利用昆虫细胞表达系统生产的较多人用疫苗或药物已批准上市。近期，美国FDA的研究人员发现，Sf9昆虫细胞(Spodopterafrugiperda)系潜伏着一种之前并未发现过的Sf弹状病毒，目前还没有证据表明该病毒能进入人类细胞系，或在细胞中进行复制。Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的重组蛋白在纯化过程中可能存在Sf弹状病毒蛋白残留，需要对其残余量进行控制。Sf弹状病毒基因组是一个不分节段的单链负义RNA。弹状病毒RNA包含5个基因，从3基端开始，它们分别是N、P、M、G和L基因。核蛋白N与RNA结合，参与控制弹状病毒RNA的复制，它也是一个潜在的免疫原，是弹状病毒的主要结构蛋白，其含量高，具有高度的保守性。在病毒的分子流行病学研究中具有重要意义。核蛋白N像一个开关，控制RNA基因产物的转录到合成全长正链RNA的转换，而新合成的正链RNA将作为模板产生新的负链RNA，从而形成新的病毒核衣壳颗粒。因此，对Sf9昆虫细胞生产的重组蛋白生物制品中的Sf弹状病毒N蛋白进行定量检测，能够对Sf弹状病毒蛋白残余量进行控制。目前国内外尚无报道有关Sf弹状病毒蛋白的检测方法和专利，因此，开发一种定量检测Sf弹状病毒蛋白的检测方法是很有必要的，既能控制昆虫细胞表达的重组蛋白生物制品中Sf弹状病毒蛋白的残留量，也能逐渐建立和完善其相关的质量标准。获得高质量的抗体是ELISA法检测蛋白含量的关键，抗原的免疫原性对抗体的效价有着直接的影响，抗体的具体制备方法对效价同样存在巨大的影响。技术实现要素：本发明的目的在于提供用于检测Sf弹状病毒N蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。本发明所采取的技术方案是：一种用于检测Sf弹状病毒N蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、Sf弹状病毒N蛋白标准品和标记的二抗，一抗为哺乳动物抗Sf弹状病毒N蛋白抗体，二抗为标记的抗Sf弹状病毒N蛋白抗体。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，哺乳动物抗Sf弹状病毒N蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用抗原免疫，注射Sf弹状病毒N蛋白；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体的制备方法为：首次免疫采用抗原多点免疫，注射Sf弹状病毒N蛋白；首次免疫后进行加强免疫，共进行3～5次加强免疫，最后一次加强免疫后取血。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，酶标板的处理方法为：将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体用包被液稀释成10～50μl成体用后加入酶标板，包被过夜，再用封闭液35～37℃封闭2-5小时，封存。作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进，标记二抗的为HRP。Sf弹状病毒N蛋白的制备方法为：1)使用引物扩增Sfrhabdovirus基因全长序列中的N蛋白基因；2)使用扩增得到的N蛋白基因构建Sf弹状病毒N基因原核表达载体并诱导表达；3)将表达得到的Sf弹状病毒N蛋白分离、纯化得到Sf弹状病毒N蛋白。一种检测Sf弹状病毒N蛋白含量的方法，包括如下步骤：1)取出豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体包被的酶标板，加入Sf弹状病毒N蛋白抗原标准品100μl，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干；2)加入HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体100μl，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用洗液洗6遍，拍干；3)加入TMB显色液，室温反应显色；4)加入硫酸终止液；5)在酶标仪上测450nm下的OD值；6)根据标准曲线得到所述待检样品中Sf弹状病毒N蛋白含量。作为上述方法的进一步改进，Sf弹状病毒N蛋白抗原标准品浓度为0ng/ml～50ng/ml。作为上述方法的进一步改进，HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体浓度为1μg/ml～2μg/ml。本发明的有益效果是：本发明的试剂盒，操作简便，检测结果准确可靠，标准曲线线性为R2＝0.9998，线性关系较好，线性范围在1ng/ml-50ng/ml，线性范围较理想。日内、日间准确度在91.3％-100.2％之间，精密度在3.2％-5.9％之间，表明试剂盒具有较好的准确度和精密度。不同批试剂盒对高、中、低浓度质控品进行测定，测定值的准确度在94.4％-99.0％之间，精密度在4.8％-5.5％之间，差异较小。附图说明图1是Sf9昆虫细胞基因组中N基因扩增结果；图2是pET32a-N工程菌扩增结果；图3是Sf弹状病毒N基因工程菌表达蛋白的SDS-PAGE分析；图4是Sf弹状病毒N蛋白纯度分析；图5是蛋白含量测定标准曲线图；图6是弹状病毒N蛋白抗体纯度；图7是Sf弹状病毒N蛋白SDS-PAGE(A)及其抗体Westernblot(B)分析；图8是检测限和定量限实验的标准曲线；图9是准确度和精密度实验的标准曲线。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实验，进一步阐述本发明。Sf弹状病毒N蛋白的制备1材料TOP10和DE3感受态细胞；原核表达载体pET-32a(+)；昆虫细胞Sf9；病毒RNA提取试剂盒；反转录试剂盒；质粒提取试剂盒；DNA胶回收试剂盒；DNAmarker；限制性内切酶和T4DNA连接酶；氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、酶标板、BSA标准品、Bradford蛋白测定试剂盒；KODFX；HisTrapFFcrude镍螯合层析柱；高速冷冻离心机；凝胶成像系统；紫外分光光度计；聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质转印系统；基因扩增仪；超声波破碎仪。2方法2.1Sf弹状病毒N基因引物设计及PCR扩增根据GenBank中登录的Sfrhabdovirus基因全长序列(NC_025382)，设计N基因引物，具体序列如下：N-PF：CGCGGATCCATGACACAGGGAACCATGAAGC(BamHI酶切位点)，N-PR：5-PR)，TCGCTTGCCGCCAAACTTGGTGTTCTC-3A(XhoI酶切位点)。2.2Sf弹状病毒N基因原核表达载体的构建2.2.1提取Sf9昆虫细胞基因组RNA；2.2.2利用反转录试剂盒进行RT-PCR；2.2.3胶回收目的条带，用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切，胶回收并纯化，再连入用相同酶消化的原核表达载体pET-32a(+)载体中，转化TOP10感受态细胞，得到pET32a-N重组表达载体；2.2.4经酶切鉴定再转化表达菌DE3感受态细胞，该菌种即为表达Sf弹状病毒N蛋白的工程菌。2.3Sf弹状病毒N基因的诱导表达2.3.1将构建好的pET32a-N工程菌接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜；2.3.2第二天按1:100的比例接种于新鲜LB培养基中，继续培养至菌液A600值约为0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.5mmol/L，诱导表达4h；2.3.3收集菌体，取1ml样品进行12％SDS-PAGE分析，同时设无N基因重组菌作为阴性对照；2.3.4确定Sf弹状病毒N蛋白表达后，用PBS(含0.5％TritonX-100)重悬菌体，冰浴中超声裂解，4℃，12000×g离心30min，收集沉淀，于-20℃保存备用。2.4Sf弹状病毒N蛋白的纯化及鉴定2.4.1用含2mol/L尿素的磷酸盐缓冲液(含500mmol/LNaCl，20mmol/L磷酸盐，pH7.4)溶解裂解后的菌体沉淀，12000×g离心30min，收集包涵体；2.4.2用含8mol/L尿素的磷酸盐缓冲液溶解包涵体，12000×g离心30min，收集上清，用0.45μm滤膜过滤；2.4.3利用HisTrapFFcrude镍螯合层析柱对Sf弹状病毒N蛋白进行纯化；2.4.4利用透析袋透析尿素，复性蛋白。2.5Sf弹状病毒N蛋白含量测定2.5.1标准曲线制备：用PBS将1mg/mlBSA标准品稀释成：300μg/ml、250μg/ml、200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、0μg/ml。2.5.2待测样品制备：用PBS将样品按4倍进行稀释。2.5.3取20μl加入96孔板中，做3个复孔，再加入200μlBradford试剂，然后在酶标仪上测595nm下的OD值。2.5.4以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线并计算待测样品蛋白含量。3结果3.1Sf9昆虫细胞基因组中N基因扩增结果图1是Sf9昆虫细胞基因组中N基因扩增结果。由结果可知，利用Sf弹状病毒N基因引物对Sf9昆虫细胞基因组进行PCR，扩增出1566bp左右的目的条带，与预期大小一致。3.2pET32a-N工程菌中N基因扩增结果结果如图2所示，由结果可知，利用Sf弹状病毒N基因引物对构建的pET32a-N工程菌进行PCR，扩增出1566bp左右的目的条带，与预期大小一致，表明载体pET-32a-N构建成功。3.3Sf弹状病毒N基因工程菌表达蛋白的SDS-PAGE分析结果如图3所示，由结果可知，Sf弹状病毒N基因工程菌在85kDa位置有大量的表达蛋白，表明该菌体能成功表达Sf弹状病毒N蛋白。3.4Sf弹状病毒N蛋白纯度分析结果如图4所示，由结果可知，Sf弹状病毒N蛋白在85kD左右，SDS-PAGE分析显示纯度较高。3.5Sf弹状病毒N蛋白含量测定表1蛋白含量测定标准曲线其标准曲线如图5所示，由图可知，标准曲线相关系数为0.9939，Sf弹状病毒N蛋白测定的含量为954μg/ml。豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体血清和兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体血清的制备1材料离心机、微型搅拌器、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、豚鼠、家兔、注射器、离心管、酒精棉、乌来糖麻醉剂。2方法2.1抗原乳化：佐剂与抗原按1:1体积比例加入离心管，在冰浴中用微型搅拌器快速搅拌进行乳化，当乳液滴入水中不扩散即可。2.2首次免疫：采用弗氏完全佐剂进行抗原乳化，豚鼠或家兔背部皮下多点免疫，前者注射Sf弹状病毒N蛋白0.2mg/只，后者注射Sf弹状病毒N蛋白0.5mg/只。2.3皮下注射操作：将豚鼠或家兔固定在手术台上，用酒精棉球消毒给药部位，左手充分提起给药部位皮肤，右手持注射器以45度角将注射针刺入皮下。确定针在皮下后缓缓注入药液。注射完毕后，用手指压住并轻柔刺入部位少许时间。2.4加强免疫：首次免疫14天后进行加强免疫，采用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，其它步骤与首次免疫相同，每次加强免疫间隔时间为10天，共进行3次加强免疫。2.5第三次加强免疫后的第5天进行心脏取血，固定好豚鼠或家兔，每只腹腔注射20％乌来糖麻醉剂进行麻醉。完全麻醉后，用剪刀剪开胸腔，暴露心脏位置，用一次性注射器从心尖处进针，针尖进入心室，缓慢回抽注射器，抽完血，拔掉针头，注射器贴着离心管壁缓慢推动，将注射器的血液沿着管壁流入离心管。2.6采集的血液于4℃过夜，第二天于3000rpm，离心10min，取上层血清于-70℃保存。间接ELISA法测定抗体血清效价1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2溶液配制2.1包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.5、0.05M)：称Na2CO31.59g、NaHCO32.93g加超纯水800ml溶解，调pH9.5后加水至1000ml。2.2磷酸盐缓冲液(PBS)：称氯化钠8g,氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g，加超纯水1000ml溶解。2.3洗液：量取0.5ml吐温-20，加，加PBS1000ml混匀。2.4封闭液：量取NBS20ml，加洗液100ml溶解。2.5稀释液：量取NBS2ml，加洗液100ml溶解。2.6终止液：量取超纯水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml。3方法3.1用Sf弹状病毒N蛋白以20μg/ml包被于96孔板，每孔加入100μl，置于4℃过夜，用洗液洗3遍，拍干。3.2每孔加入200μl封闭液，于37℃孵育2小时，用洗液洗3遍，拍干。3.3将兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体血清和豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体血清按1:10000、1:50000、1:100000和1:200000比例稀释(阴性对照血清按相同倍比稀释)，每孔加入100μl，37℃孵育1小时，用洗液洗3遍，拍干。3.4兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体血清组加入HRP标记的羊抗兔1:10000，豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体血清组加入HRP标记的羊抗鼠1:10000，每孔加100μl，37℃孵育1h，用洗液洗6遍，拍干。3.5每孔加入100μlTMB显色液，室温显色反应10min。3.6每孔加入50μl终止液终止反应。3.7在酶标仪上测450nm下的OD值。当样品吸光值/阴性吸光值>2.1时，即认为是阳性，同时计算效价。4结果表2兔抗弹状病毒N蛋白抗体血清效价表3豚鼠抗弹状病毒N蛋白抗体血清效价由结果可知，兔抗弹状病毒N蛋白抗体血清和豚鼠抗弹状病毒N蛋白抗体血清的效价均大于1:200000，具有较高的效价。抗体纯化1材料ProteinAsepharose，纯化仪，十二水磷酸氢二钠，，二水磷酸二氢钠，氯化钠，柠檬酸，Tris，氯化钾，磷酸二氢钾，0.45μm滤膜，透析袋。2溶液配制2.1250mMNa2HPO4：称取Na2HPO4.12H2O26.86g，加超纯水250ml，搅拌溶解，再加超纯水定容至300ml。2.2250mMNaH2PO4：称取NaH2PO4.2H2O2.75g，加超纯水70ml，搅拌溶解，再加超纯水定容至80ml。2.3250mMPB(pH7.4)：取250mMNa2HPO4溶液300ml，加入250mMNaH2PO471ml。2.4BufferA(25mMPB，0.3MNaCl，pH7.4)：取250mMPB缓冲液100ml，称取NaCl17.53g，加超纯水800ml搅拌溶解，再加超纯水定容至1000ml。2.5BufferB(0.1M柠檬酸，pH3.0)：称取柠檬酸10.50g，加超纯水400ml搅拌溶解，用1MNaOH溶解，调pH至3.0，再加超纯水定容至500ml。2.6BufferC(1MTris-Base)：称取Tris-Base12.11g，加超纯水80ml搅拌溶解，调pH8.0，再加超纯水定容至100ml。2.7磷酸盐缓冲液(PBS)：称取氯化钠8g,氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g，加超纯水1000ml溶解，调pH7.4，再加超纯水定溶至1000ml。3方法3.1将血清样品稀释3倍，补加NaCl浓度至2M，12000×g离心15min，取上清液，再过0.45μm滤膜。3.2ProteinA层析柱用BufferA平衡，流速3ml/min。3.3将处理过的样品以2.5ml/min的流速经过层析柱。3.4用BufferA缓冲液以3ml/min的流速冲洗层析柱。3.5用BuffeB缓冲液以3ml/min的流速经过层析柱，观察280nm波长吸收值的变化，当280nm呈直线上升时，立即收集洗脱样品，至吸收值回归至基线水平停止收集，按每1ml洗脱液加入40μlBufferC进行中和pH值至7.0～7.4范围。3.6将洗脱样品，装进透析袋，在PBSpH7.4缓冲液中透析，4℃，过夜。抗体验证1材料电泳仪，电泳槽，电磁炉，台式高速离心机，离心管，海绵，滤纸，PVDF膜，镊子，剪子，计时器，X-光片，X-光片暗夹，托盘，暗室灯，小塑料盒，显影液，定影液，ECL化学发光试剂。2溶液配制2.1电泳缓冲液：TrisBase3.0g；甘氨酸18.8g；SDS1g；加超纯水至1000ml。2.2转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加超纯水定容至1000ml。2.3PBS(0.01M，pH7.4))：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加超纯水至1000ml。2.4PBST：吐温-200.5ml，加入PBS1000ml。2.5膜染色液：考马斯亮兰0.25g；甲醇45ml；乙酸10ml；加超纯水至100ml。2.6封闭液(5％脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉5g溶于1000mlPBST。3方法3.1SDS-PAGE电泳3.1.1制胶：按比例配制8％分离胶及5％浓缩胶，完全聚合后使用。3.1.2预电泳：拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10V进行预电泳20min。3.1.3样品准备：按样品:上样buffer为4:1体积比加入上样bufer混匀，沸水煮10min，冰上5min。3.1.4加样：预电泳后加入标准品和待分析样品。每个泳道上样10μl。3.1.5电泳：加样完毕，选择90V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处，更换至130V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。3.2染色3.2.1切胶：将电泳完毕的胶割取左半部分去掉浓缩胶部分并放在盛有电转液的玻璃皿中，另外部分放在盛有考马斯亮蓝染色液的玻璃皿中。3.2.2置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1h或更长时间。3.2.3倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色1h。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色30min后即可出现。3.2.4完成脱色后，用超纯水浸泡，并扫描最终结果。3.3转膜3.3.1切胶：将电泳完毕的胶去掉浓缩胶部分，其余完整的放在盛有电转液的玻璃皿中。3.3.2剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小0.5～1mm，PVDF膜长宽较凝胶大0.5～1mm)，膜放入甲醇中10s，然后将两者都放入盛有电转液的玻璃皿中5min。3.3.3向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”,从正极到负极按如下顺序排列：正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极。(其中不能留有气泡)卡紧转膜板，电转槽中倒满电转液，将转膜板浸入电转槽中，注意正负极要正确。插上电源，设定恒流200mA转膜，冰浴电转60min。3.4膜的封闭：用PBST液洗涤印迹膜10s，加入5％脱脂奶粉封闭液，室温轻柔摇动封闭1.5h。3.5一抗孵育：按相应抗体的效价加入PBST稀释一抗，加入一抗约10ml，室温轻柔摇动孵育2h，用PBST洗涤膜4次，每次5min。3.6二抗孵育：按相应抗体的效价加入PBST稀释的二抗，加入二抗约10ml，室温轻柔摇动孵育1h，用PBST洗涤膜4次，每次5min。3.7ECL显色：在避光的容器中按A液:B液＝1:1的比例配制1ml，将ECL工作液覆盖到膜表面，放置1min后在凝胶成像系统中观察拍照或者暗房内显影曝光。4结果结果如图6和图7所示。由结果可知，纯化的兔抗弹状病毒N蛋白抗体和豚鼠抗弹状病毒N蛋白抗体纯度较高。纯化的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体能够与Sf弹状病毒N蛋白特异性结合，具有较高的特异性。辣根过氧化物酶标记兔抗弹状病毒N蛋白抗体1材料高碘酸钠(NaIO4)、硼氢化钠(NaBH4)、醋酸钠(NaAc)、醋酸(HAc)、碳酸钠(Na2CO3)、碳酸氢钠(NaHCO3)、硫酸铵、超纯水、透析袋。2溶液配制2.10.1MNaIO4：称取241mg高碘酸钠溶于10ml蒸馏水中(需新鲜配制)。2.21mMPH4.4醋酸钠缓冲液：取0.2MNaAc(1.361g/50ml)3.7ml，0.2MHAc(0.601ml/50ml)6.3ml，加超纯水至2000ml。2.30.2MpH9.5碳酸盐缓冲液：称取Na2CO30.32g，NaHCO30.586g，加超纯水至50ml，再用超纯水作20倍稀释，即成0.01MpH9.5的碳酸盐缓冲液。2.4NaBH4溶液(4mg/ml)：临用时称取NaBH44mg溶于1ml超纯水中。2.5磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)：称量KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8.0g，KCl0.2g加超纯水至1000ml，调pH7.4。2.6100％饱和硫酸铵：称取767g硫酸铵，加入超纯水1000ml，微波加热溶解，静置过夜，第二天有结晶析出，取上清即可。2.7半饱和硫酸铵：将100％饱和硫酸铵溶液按1:1体积比稀释。3方法3.1称取2mgHRP溶解于2ml超纯水中。3.2于上液中加入0.4ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20min。3.3将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。3.4加入40μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入约3mg抗体在2ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2h。3.5加入0.2ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2h。3.6将上述混合液装入透析袋中，在PBS缓冲液中透析，4℃过夜。3.7将混合液从透析袋倒入离心管中，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。3.8于3000rpm，4℃离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物用3mlPBS溶解。3.9将上述混合液装入透析袋中，对PBS缓冲液透析，去除铵离子后，12,000rpm离心10min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，于-20℃保存。棋盘法确定包被抗体和检测抗体的浓度1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2溶液配制2.1包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.5、0.05M)：称Na2CO31.59g、NaHCO32.93g加超纯水800ml溶解，调pH9.5后加水至1000ml。2.2磷酸盐缓冲液(PBS)：称氯化钠8g,氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g，加超纯水1000ml溶解。2.3洗液：量取0.5ml吐温-20，加，加PBS1000ml混匀。2.4封闭液：量取NBS20ml，加洗液100ml溶解。2.5稀释液：量取NBS2ml，加洗液100ml溶解。2.6终止液：量取超纯水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml。3方法3.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:50、1:100、1:200、1:500和1:1000进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。3.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。3.3加样：用稀释液将Sf弹状病毒N蛋白稀释成500ng/ml和0ng/ml，每份样品加入100μl，做2个复孔，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。3.4加检测抗体：用稀释液将HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:200、1:400、1:800和1:1600稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。3.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。3.6加终止液：每孔加入50μl终止液。3.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。4结果表4棋盘法优化结果由结果可知，当包被抗体为1:500，检测抗体为1:400时，结果较理想。检测限和定量限1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2溶液配制2.1包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.5、0.05M)：称Na2CO31.59g、NaHCO32.93g加超纯水800ml溶解，调pH9.5后加水至1000ml。2.2磷酸盐缓冲液(PBS)：称氯化钠8g,氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g，加超纯水1000ml溶解。2.3洗液：量取0.5ml吐温-20，加，加PBS1000ml混匀。2.4封闭液：量取NBS20ml，加洗液100ml溶解。2.5稀释液：量取NBS2ml，加洗液100ml溶解。2.6终止液：量取超纯水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml。3方法检测限(灵敏度)是对20份阴性对照样品进行测定，取平均值后加2倍标准差，即X+2S，代入标准方程中，计算出来的浓度即为本试剂盒的灵敏度，重复3次实验。定量限是将Sf弹状病毒N蛋白稀释至最低浓度，最低浓度的准确度应在80％-120％，变异系数应小于20％，重复5次实验。3.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:500进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。3.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。3.3加样：用稀释液将Sf弹状病毒N蛋白稀释成50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml和0ng/ml，每份样品加入100μl，做4个复孔，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。3.4加检测抗体：用稀释液将HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:400稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。3.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。3.6加终止液：每孔加入50μl终止液。3.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。3结果表5检测限表6定量限实验编号理论值(ng/ml)平均测量值(ng/ml)准确度(％)CV(％)110.99199.14.0211.086108.64.1310.97397.36.1411.153115.34.6511.138113.83.0由结果可知，Sf弹状病毒N蛋白双抗夹心Elisa法的检测限为0.36ng/ml，定量限为1ng/ml。标准曲线的确定1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2溶液配制2.1包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.5、0.05M)：称Na2CO31.59g、NaHCO32.93g加超纯水800ml溶解，调pH9.5后加水至1000ml。2.2磷酸盐缓冲液(PBS)：称氯化钠8g,氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g，加超纯水1000ml溶解。2.3洗液：量取0.5ml吐温-20，加，加PBS1000ml混匀。2.4封闭液：量取NBS20ml，加洗液100ml溶解。2.5稀释液：量取NBS2ml，加洗液100ml溶解。2.6终止液：量取超纯水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml。3方法3.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:500进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。3.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。3.3加样：用稀释液将Sf弹状病毒N蛋白稀释成50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0ng/ml，每份样品加入100μl，做4个复孔，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。3.4加检测抗体：用稀释液将HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:400稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。3.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。3.6加终止液：每孔加入50μl终止液。3.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。3结果表7标准曲线浓度(ng/ml)平均OD值CV(％)501.16104.6200.57232.0100.33231.950.20351.220.11107.310.07633.500.04826.1其标准曲线如图8所示。由结果可知，标准曲线线性为R2＝0.9998，线性关系较好，线性范围在1ng/ml-50ng/ml，线性范围较理想。准确度和精密度1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2方法日内准确度和精密度是一天内分别对高、中、低浓度(30ng/ml、12ng/ml、3ng/ml)进行测定，每个浓度重复20次。日间准确度和精密度是每天分别对高、中、低浓度(30ng/ml、12ng/ml、3ng/ml)进行测定，每个浓度重复4次，测定5天。2.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:500进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。2.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.3加样：加入50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0ng/ml标准品溶液和30ng/ml、12ng/ml、3ng/ml质控品溶液，每孔100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.4加检测抗体：加入HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体溶液，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。2.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。2.6加终止液：每孔加入50μl终止液。2.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。3结果3.1日内准确度和精密度表8标准曲线浓度(ng/ml)平均OD值CV(％)501.15832.1200.57682.2100.32031.850.18952.720.10582.510.07584.000.0494.5其标准曲线如图9所示。表9日内准确度和精密度理论值(ng/ml)实际测定平均值(ng/ml)准确度(％)CV(％)高浓度(30)27.491.33.2中浓度(12)10.990.83.9低浓度(3)2.8995.85.93.2日间准确度和精密度表10标准曲线方程时间标准曲线方程相关系数(R2)1dY＝-0.0001x2+0.029x+0.048512dY＝-0.0002x2+0.0346x+0.04760.99983dY＝-0.0001x2+0.0291x+0.05130.99994dY＝-0.0002x2+0.0309x+0.04960.99985dY＝-0.0002x2+0.033x+0.05420.9999表11日间准确度和精密度理论值(ng/ml)实际测定平均值(ng/ml)准确度(％)CV(％)高浓度(30)30.1100.25.0中浓度(12)11.697.04.4低浓度(3)2.996.14.6由结果可知，日内、日间准确度在91.3％-100.2％之间，精密度在3.2％-5.9％之间，表明试剂盒具有较好的准确度和精密度。批间差异1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2方法2.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:500进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。2.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.3加样：加入50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0ng/ml标准品溶液和30ng/ml、12ng/ml、3ng/ml质控品溶液，每孔100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.4加检测抗体：加入HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体溶液，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。2.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。2.6加终止液：每孔加入50μl终止液。2.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。3结果表12批间差异分析理论值(ng/ml)实际测定平均值(ng/ml)准确度(％)CV(％)高浓度(30)29.799.05.5中浓度(12)11.797.24.8低浓度(3)2.894.44.8由结果可知，不同批试剂盒对高、中、低浓度质控品进行测定，测定值的准确度在94.4％-99.0％之间，精密度在4.8％-5.5％之间，差异较小。Sf9昆虫细胞蛋白中Sf弹状病毒N蛋白含量测定1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2方法2.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:500进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。2.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.3加样：加入50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0ng/ml标准品溶液和Sf9昆虫细胞蛋白溶液300μg/ml和150μg/ml，每孔100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.4加检测抗体：加入HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体溶液，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。2.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。2.6加终止液：每孔加入50μl终止液。2.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。3结果表13Sf9昆虫细胞蛋白中Sf弹状病毒N蛋白含量测定由结果可知，Sf弹状病毒N蛋白在Sf9昆虫细胞蛋白中占的比例为0.0022％。重组蛋白疫苗中Sf弹状病毒N蛋白含量测定1材料酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。2方法2.1包被：用包被液将豚鼠抗Sf弹状病毒N蛋白抗体按1:500进行稀释，包被于96孔板，每孔加100μl，放入4℃冰箱过夜。2.2封闭：弃去孔内液体，用洗液洗3遍，拍干。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h后，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.3加样：加入50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0ng/ml标准品溶液和重组蛋白疫苗纯化样品，每孔100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤3次，拍干。2.4加检测抗体：加入HRP标记的兔抗Sf弹状病毒N蛋白抗体溶液，每孔加100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗涤6次，拍干。2.5加显色液：每孔加入100μlTMB显色液，室温下避光反应20min。2.6加终止液：每孔加入50μl终止液。2.7检测：15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。3结果重组蛋白疫苗纯化样品中Sf弹状病毒N蛋白含量测定的OD值接近于阴性对照值，含量低于线性范围最低值1ng/ml，表明Sf弹状病毒N蛋白在重组蛋白疫苗纯化样品中的含量很低。SEQUENCELISTING<110>广东华南联合疫苗开发院有限公司<120>Sf弹状病毒N蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法<130>Sf<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>31<212>DNA<213>人工引物<400>1cgcggatccatgacacagggaaccatgaagc31<210>2<211>30<212>DNA<213>人工引物<400>2gggaagcttgccgccaaacttggtgttctc30当前第1页1 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