一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法与流程

本发明涉及化合物的提取富集及检测领域，具体地说涉及一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法。

背景技术：

石斛为兰科石斛属植物，是一种常用名贵中药。我国约有石斛属植物76种，目前供作药用的原植物为45种。石斛的主要药用成分包括多糖、生物碱和茋类。

其中，石斛酚作为石斛中特有的茋类化合物其含量约为0.001％，对胃癌细胞，肝癌细胞均有抑制活性，是石斛药用成分研究的热点。石斛酚(gigantol)4,4’-二羟基-2’,3-二甲氧基联苄，其化学结构式如下：

目前对于石斛酚的研究多集中于药理药效，而对其含量的检测在石斛酚的深入研究以及石斛的种植鉴定过程中都是非常重要的，因此开发一种能有效分离检测石斛酚的分析方法是非常必要的。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别称取石斛酚标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋30s～60s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

称取铁皮石斛样品，然后用甲醇水溶液作为提取溶剂对铁皮石斛样品进行提取，得到铁皮石斛提取液，之后将铁皮石斛提取液中的溶剂除干，再复溶于色谱级甲醇中，然后放置12～24小时，最后进行过滤处理，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)供试品溶液的测定

采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um，柱温20℃～60℃，进样量1μL～50μL，流速1.0mL/min，流动相为乙腈和甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～40min，有机相在流动相里的比例从5％～20％升至80％～90％。

进一步地，步骤(2)中，所述甲醇水溶液的体积浓度为60％～80％。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用这种提取溶剂的提取效果较好，从而保证对石斛酚的检测的准确性。

进一步地，步骤(2)中，提取的具体过程为：按照0.5g/1ml～2ml的比例将铁皮石斛样品浸于甲醇水溶液中，然后在40℃～60℃的温度下超声处理15min～60min，再在4000rpm～6000rpm的转速下离心处理15min～20min，取上清液，重复以上过程2～4次，合并上清液，即为所述铁皮石斛提取液。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用以上提取工艺，能够令铁皮石斛中的石斛酚充分析出，从而保证对石斛酚的检测的准确性。

进一步地，步骤(2)中，将铁皮石斛提取液中的溶剂除干的方式为用氮气吹干。

进一步地，步骤(2)中，复溶时每0.5g铁皮石斛样品使用200μL～500μL色谱级甲醇。

进一步地，步骤(2)中，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.22μm～0.45μm。

进一步地，步骤(3)中，流动相的甲酸水溶液的体积浓度为0.01％～0.1％。

进一步地，二极管阵列检测器的检测波长为190nm～400nm。

进一步地，石斛酚在24.107min～24.352min，230nm～300nm处有最大吸收峰。

本发明的有益效果体现在：

1.本发明工艺简单，操作方便、高效，应用成本低，而且检测灵敏度、精确度和准确度较高，回收率也非常高。

2.本发明采用甲醇水溶液作为提取剂，既能高效提取石斛酚，又能避免过多大极性杂质的干扰。

3.本发明确定了石斛酚24.107min～24.352min，230nm～300nm处有最大吸收峰。

4.本发明的提取过程采用超声能够破碎细胞，使提取更充分，重复提取可以使石斛酚充分溶解于甲醇中，由于石斛酚含量较低，浓缩复溶可以提高溶液中石斛酚的浓度，便于检测。

附图说明

图1为石斛酚标准品的紫外吸收光谱。

图2为石斛酚标准品的液相色谱图。

图3为实施例1得到的标准曲线。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。

以下实施例所使用的石斛酚标准品购自中国药品生物制品检定所。

实施例1

一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别称取石斛酚标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋45s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

称取0.5g铁皮石斛样品，然后用体积浓度为80％的甲醇水溶液作为提取溶剂对铁皮石斛样品进行提取，提取的具体过程为：按照0.5g/2ml的比例将铁皮石斛样品浸于甲醇水溶液中，然后在50℃的温度下超声处理30min，再在6000rpm的转速下离心处理20min，取上清液，重复以上过程2次，第一次超声离心处理时，对浸于甲醇水溶液中的铁皮石斛样品进行研磨处理，合并上清液，即为铁皮石斛提取液，之后用氮气将铁皮石斛提取液吹干，再复溶于300μL色谱级甲醇中，然后放置18小时，最后进行过滤处理，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.22μm，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)供试品溶液的测定

采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um，柱温25℃，进样量20μL，流速1.0mL/min，流动相为乙腈和体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～40min，有机相在流动相里的比例从5％升至80％；

二极管阵列检测器的检测波长为279nm；

(4)结果解析

在检测之前，首先对石斛酚标准品进行紫外可见光谱分析，得到石斛酚的紫外可见光谱图，参见图1，200μg/mL标准品溶液的液相色谱图参见图2，经过分析得知，石斛酚在24.352min，279nm处有最大吸收峰。

通过对标准品溶液的测定，绘制出标准曲线，参见图3，得到石斛酚含量计算公式如下：y＝3.7649x+0.0481，y为浓度(μg/mL)、x为峰面积；

实施例2

一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别称取石斛酚标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋30s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

称取0.5g铁皮石斛样品，然后用体积浓度为60％的甲醇水溶液作为提取溶剂对铁皮石斛样品进行提取，提取的具体过程为：按照0.5g/1ml的比例将铁皮石斛样品浸于甲醇水溶液中，然后在40℃的温度下超声处理60min，再在4000rpm的转速下离心处理15min，取上清液，重复以上过程3次，第一次超声离心处理时，对浸于甲醇水溶液中的铁皮石斛样品进行研磨处理，合并上清液，即为铁皮石斛提取液，之后用氮气将铁皮石斛提取液吹干，再复溶于200μL色谱级甲醇中，然后放置24小时，最后进行过滤处理，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.45μm，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)供试品溶液的测定

采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um，柱温20℃，进样量1μL，流速1.0mL/min，流动相为乙腈和体积浓度为0.01％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～40min，有机相在流动相里的比例从10％升至85％；

二极管阵列检测器的检测波长为190nm；

(4)结果解析

经过测定后，对谱图进行分析，结果与实施例1相似，石斛酚在24.107min～24.352min，230nm～300nm处有最大吸收峰，得到石斛酚含量计算公式如下：y＝3.7653x+0.0481，y为浓度(μg/mL)、x为峰面积。

实施例3

一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别称取石斛酚标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋60s，制成200μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

称取0.5g铁皮石斛样品，然后用体积浓度为70％的甲醇水溶液作为提取溶剂对铁皮石斛样品进行提取，提取的具体过程为：按照0.5g/1.5ml的比例将铁皮石斛样品浸于甲醇水溶液中，然后在60℃的温度下超声处理15min，再在5000rpm的转速下离心处理18min，取上清液，重复以上过程4次，第一次超声离心处理时，对浸于甲醇水溶液中的铁皮石斛样品进行研磨处理，合并上清液，即为铁皮石斛提取液，之后用氮气将铁皮石斛提取液吹干，再复溶于500μL色谱级甲醇中，然后放置12小时，最后进行过滤处理，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.35μm，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)供试品溶液的测定

采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um，柱温60℃，进样量50μL，流速1.0mL/min，流动相为乙腈和体积浓度为0.06％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～40min，有机相在流动相里的比例从20％升至90％；

二极管阵列检测器的检测波长为400nm；

(4)结果解析

经过测定后，对谱图进行分析，结果与实施例1相似，石斛酚在24.107min～24.352min，230nm～300nm处有最大吸收峰，得到石斛酚含量计算公式如下：y＝3.7649x+0.0481，y为浓度(μg/mL)、x为峰面积。

实施例4

精密度试验

取6份石斛酚标准溶液，按实施例1的方法检测石斛酚标准溶液的中石斛酚含量，检测结果见下表1。

表1

试验结论：6份石斛酚标准溶液含量的RSD为1.2％，表明本发明有较好的精密度，符合GB/T 27404-2008质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(％)≤1.3％】。

实施例5

回收率试验

精密称取6组样品，每组样品中有两份等质量的铁皮石斛样品，分别向6组样品的中的其中一份铁皮石斛样品中加入石斛酚对照品，按实施例1的方法分别检测6组石斛酚含量，计算每组的回收率，测得对照品投入量＝加标样品测得量－非加标样品测得量；回收率(％)＝测得对照品投入量/对照品实际投入量，检测结果见下表2。

表2

试验结论：石斛酚加标平均回收率为：96.408％，相对标准偏差(RSD)分别为0.32％，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-2008要求回收率为95％～105％】

另外，对实施例2和3也分别进行测试，结果为实施例2的精密度为1.37，回收率为96.261％，实施例3的精密度为1.35，回收率为95.873％。

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。