一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法与流程

本发明涉及生物小分子同型半胱氨酸的检测方法技术领域，尤其是涉及一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法。

背景技术：

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，或称为高半胱氨酸，是氨基酸半胱氨酸的异种，其侧链中含有巯基(-SH)。Hcy主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。1969年Mccully从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现,其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化(AS)的病理表现，由此提出高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHCY)可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。Hcy可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。

同型半胱氨酸的测定方法除了传统的高效液相色谱法、酶免疫分析法、荧光偏振法等外，近几年也出现了以甲硫氨酸和腺苷同型半胱氨酸为基础的循环酶法(参见中国专利CN200480026009.4)，但由于关键原料的生产技术难以掌握且成本很高，难以形成市场应用。

传统的酶免疫分析法的基本分析原理是酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，其步骤为：先使用酶将血样中所有形式的Hcy转变成s-腺苷-L-Hcy,然后加入酶标的抗s-腺苷-L-Hcy的单克隆或多克隆抗体，采用竞争结合的原理，将不同水平的标准品与酶标抗体竞争结合，然后以显色试剂和终止试剂分别进行显色和终止，制作出hcy浓度与发色强度的标准曲线。样品也按相同步骤处理，在标准曲线上就可以查出其Hcy的浓度。

技术实现要素：

为了克服背景技术中的不足，本发明公开了区别于传统测定方法和现有循环酶法的体液中同型半胱氨酸的测定方法，该方法是以四氢叶酸为基础产生循环反应，通过累积生成还原型辅酶I(NADH)放大检测信号，在波长340nm进行测定，NADH与参与反应的同型半胱氨酸浓度成正比。该反应中涉及关键酶包括：甲硫氨酸合成酶(EC 2.1.1.13)、氨基甲基转移酶(EC 2.1.2.10)、甘氨酸羟基甲基转移酶(EC 2.1.2.1)，用于同型半胱氨酸的循环检测。本发明同时还公开了基于上述检测方法的同型半胱氨酸检测的试剂，该试剂能够广泛应用于临床中同型半胱氨酸的检测。

为了实现所述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，包括两个反应物的循环反应，分别是四氢叶酸循环反应和5，10-甲基四氢叶酸循环反应；

所述四氢叶酸循环反应为5-甲基四氢叶酸与L-高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L-甲硫氨酸后，再以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD⁺反应生成5，10-甲基四氢叶酸和NADH；

所述5，10-甲基四氢叶酸循环反应为将四氢叶酸循环反应中生成的5，10-甲基四氢叶酸为反应底物，与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸；

通过检测340nm波长处NADH的吸光度上升程度，测算出L-高半胱氨酸的浓度大小测定结果。

为了进一步改进技术方案，本发明所述四氢叶酸循环反应中，5-甲基四氢叶酸与L-高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L-甲硫氨酸的反应步骤中，使用的酶为甲硫氨酸合成酶，所述反应的反应式为：5-甲基四氢叶酸+L-高半胱氨酸→四氢叶酸+L-甲硫氨酸。

为了进一步改进技术方案，本发明所述四氢叶酸循环反应中，以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD⁺反应生成5，10-甲基四氢叶酸和NADH的反应步骤中，使用的酶为氨基甲基转移酶；所述反应的反应式为：甘氨酸+四氢叶酸+NAD⁺→5，10-甲基四氢叶酸+NH₃+CO₂+NADH+H⁺。

为了进一步改进技术方案，本发明所述5，10-甲基四氢叶酸循环反应中，5，10-甲基四氢叶酸与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸的反应步骤中，使用的酶为甘氨酸羟甲基转移酶；所述反应的反应式为：5，10-甲基四氢叶酸+甘氨酸+H₂O→四氢叶酸+丝氨酸。

一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：其测试步骤为：

S1:配制试剂盒：所述试剂盒试剂包含以下各组分：缓冲液：Tris，反应底物5-甲基四氢叶酸钙，反应底物甘氨酸，反应底物NAD⁺，酶激活离子MgCl₂，甲硫氨酸合成酶，氨基甲基转移酶，甘氨酸羟甲基转移酶；

S2：取步骤S1中的缓冲液Tris，溶解于纯化水中，并用浓盐酸调节pH值；

S3：依次称取步骤S1中的5-甲基四氢叶酸、甘氨酸、NAD⁺、MgCl₂，并加入步骤S2的溶液中，搅拌至完全溶解；

S4：取步骤S1中配制好的试剂甲硫氨酸合成酶、氨基甲基转移酶和甘氨酸羟甲基转移酶并各自单独溶解后，加入步骤S3所述的溶液中，搅拌混匀；

S5：测定步骤S4的混匀溶液的PH值，并调节pH值，加入纯化水定容，然后过滤后置于2-8℃备用；

S6：将步骤S5中过滤后的溶液置于水浴平衡后得反应液，并配制浓度为0.05mM的L-HCY溶液作为检测物；

S7：按反应液：检测物按比例，在生化分析仪上设定反应参数，并记录每一读点的吸光度，用于计算吸光度变化率。

为了进一步改进技术方案，本发明所述步骤S1的试剂盒中各组分的浓度为：缓冲液Tris：20mM-50mM；反应底物5-甲基四氢叶酸钙：5mM-10mM；反应底物甘氨酸：10mM-20mM；NAD⁺1mM-5mM；酶激活离子MgCl₂：2mM-10mM；甲硫氨酸合成酶：5-15kU/L；氨基甲基转移酶：1-4kU/L；甘氨酸羟甲基转移酶：2-6kU/L。

为了进一步改进技术方案，本发明所述步骤S2和步骤S5中调节后的PH值为至8.00±0.05；所述步骤S5中加入纯化水定容至500ml，将定容后溶液通过0.22μm膜过滤。

为了进一步改进技术方案，本发明所述步骤S6中水浴温度为37℃，平衡时间为15-20min。

为了进一步改进技术方案，本发明所述步骤S7中反应液：检测物的比例为50:1。

为了进一步改进技术方案，本发明所述试剂Tris、5-甲基四氢叶酸钙、甘氨酸、NAD⁺和MgCl₂，均为Sigma公司生产的试剂。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明所述检测同型半胱氨酸的酶循环方法，包括两个反应物的循环反应，主要是通过四氢叶酸和5,10-甲基四氢叶酸之间的双循环反应，在L-高半胱氨酸的启动下使NADH(还原型辅酶I)不断累积，即在340nm波长处吸光度不断增加，使检测信号不断增强，简接获得参与反应的L-高半胱氨酸的浓度。各反应如下：

1)5-甲基四氢叶酸+L-高半胱氨酸→四氢叶酸+L-甲硫氨酸，该反应过程中，使用甲硫氨酸合成酶作为反应酶；

2)甘氨酸+四氢叶酸+NAD⁺→5，10-甲基四氢叶酸+NH₃+CO₂+NADH+H⁺，该反应过程中，使用氨基甲基转移酶作为反应酶；

3)5，10-甲基四氢叶酸+甘氨酸+H₂O→四氢叶酸+丝氨酸，该反应过程中，使用甘氨酸羟甲基转移酶作为反应酶。

本发明所述的双循环，第一个循环反应：是上述反应1)和反应2)中的四氢叶酸循环反应，四氢叶酸在反应1)中为产物，在反应2)中为底物；第二个循环反应：是上述反应2)和反应3)中的5，10-甲基四氢叶酸循环，5，10-甲基四氢叶酸在反应2中为产物，在反应3中为底物；当反应启动时，四氢叶酸和5，10-甲基四氢叶酸的浓度会维持在一定水平，不断消耗和产生，而反应2中的NADH(最终的指示物)浓度则会不断累积，增加在波长340nm处的吸光度，并且与反应1中的L-高半胱氨酸浓度相关，使测定L-高半胱氨酸灵敏度增加。

当反应为非循环反应时，其灵敏度主要与初始的反应物浓度相关，只能在一定范围内增加；当反应为单循环反应时，其灵敏度主要与初始反应物以及循环反应物浓度相关，相对非循环反应能够大大提高灵敏度；当反应为双循环反应时，将反应信号提高明显，增强反应灵敏度，其灵敏度主要与初始反应物以及循环反应物浓度相关，相对单循环反应能够大大提高灵敏度。

附图说明

图1为实施例一至实施例三的反应曲线图。

图2为实施例一至实施例三在22-23范围读点的反应曲线图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。

实施例一

S1：配制试剂盒，所述试剂盒试剂包含以下各组分的物质：浓度为20mM的Tris缓冲液；浓度为5mM的5-甲基四氢叶酸钙；浓度为10mM的甘氨酸；浓度为1mM的NAD⁺；浓度为2mM的MgCl₂；浓度为5kU/L的甲硫氨酸合成酶；浓度为1kU/L的氨基甲基转移酶；浓度为2kU/L的甘氨酸羟甲基转移酶。

S2：称取1.211g步骤S1中的Tris缓冲液，溶解于300ml纯化水中，并用浓盐酸调节pH至8.00±0.05；

S3：称取步骤S1中的5-甲基四氢叶酸钙1.244g，甘氨酸0.375g，NAD⁺0.331g和MgCl₂0.203g加入到步骤S2的缓冲溶液内，搅拌至完全溶解；

S4：称取步骤S1中的甲硫氨酸合成酶2.5kU、氨基甲基转移酶0.5kU、甘氨酸羟甲基转移酶1kU，并单独溶解后，加入步骤S3的溶液中，搅拌至充分混匀；

S5：测定上述溶液pH值，并调节pH至8.00±0.05，使用500ml量筒加入纯化水定容至500ml。将定容后溶液通过0.22μm膜过滤，置于2～8℃备用。

S6:将步骤S5中过滤后的溶液置于置于37℃水浴中平衡15min后得反应液，并配制浓度为0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作为检测物；

S7：按反应液：检测物按50：1的比例，在生化分析仪上设定反应参数，并记录每一读点的吸光度，用于计算吸光度变化率。

实施例二

S1：配制试剂盒，所述试剂盒试剂包含以下各组分的物质：浓度为35mM的Tris缓冲液；浓度为7.5mM的5-甲基四氢叶酸钙；浓度为15mM的甘氨酸；浓度为3mM的NAD⁺；浓度为3.5mM的MgCl₂；浓度为7.5kU/L的甲硫氨酸合成酶；浓度为3kU/L的氨基甲基转移酶；浓度为4kU/L的甘氨酸羟甲基转移酶。

S2：称取2.120g步骤S1中的Tris缓冲液，溶解于300ml纯化水中，并用浓盐酸调节pH至8.00±0.05；

S3：称取步骤S1中的5-甲基四氢叶酸钙1.866g，甘氨酸0.563g，NAD⁺0.994g和MgCl₂0.356g加入到步骤S2的缓冲溶液内，搅拌至完全溶解；

S4：称取步骤S1中的甲硫氨酸合成酶3.75kU、氨基甲基转移酶1.5kU、甘氨酸羟甲基转移酶2kU，并单独溶解后，加入步骤S3的溶液中，搅拌至充分混匀；

S5：测定上述溶液pH值，并调节pH至8.00±0.05，使用500ml量筒加入纯化水定容至500ml。将定容后溶液通过0.22μm膜过滤，置于2-8℃备用。

S6:将步骤S5中过滤后的溶液置于置于37℃水浴中平衡15min后得反应液，并配制浓度为0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作为检测物；

S7：按反应液：检测物按50：1的比例，在生化分析仪上设定反应参数，并记录每一读点的吸光度，用于计算吸光度变化率。

实施例三

S1：配制试剂盒，所述试剂盒试剂包含以下各组分的物质：浓度为50mM的Tris缓冲液；浓度为10mM的5-甲基四氢叶酸钙；浓度为20mM的甘氨酸；浓度为5mM的NAD⁺；浓度为5mM的MgCl₂；浓度为10kU/L的甲硫氨酸合成酶；浓度为5kU/L的氨基甲基转移酶；浓度为6kU/L的甘氨酸羟甲基转移酶。

S2：称取3.029g步骤S1中的Tris缓冲液，溶解于300ml纯化水中，并用浓盐酸调节pH至8.00±0.05；

S3：称取步骤S1中的5-甲基四氢叶酸钙2.488g，甘氨酸0.751g，NAD⁺1.656g和MgCl₂0.508g加入到步骤S2的缓冲溶液内，搅拌至完全溶解；

S4：称取步骤S1中的甲硫氨酸合成酶5kU、氨基甲基转移酶2.5kU、甘氨酸羟甲基转移酶3kU，并单独溶解后，加入步骤S3的溶液中，搅拌至充分混匀；

S5：测定上述溶液pH值，并调节pH至8.00±0.05，使用500ml量筒加入纯化水定容至500ml。将定容后溶液通过0.22μm膜过滤，置于2-8℃备用。

S6:将步骤S5中过滤后的溶液置于置于37℃水浴中平衡15min后得反应液，并配制浓度为0.05mM的L-高半胱氨酸溶液作为检测物；

S7：按反应液：检测物按50：1的比例，在生化分析仪上设定反应参数，并记录每一读点的吸光度，用于计算吸光度变化率。

实施例一至三的测定结果如下表所示：

通过反应结果显示，三个实施例均呈现出较好的线性关系，在实施例一中显示的各反应物的浓度范围内，该反应原理可以实施，并当反应物浓度增高时，反应变化率(ΔA/min)也会增加，但当浓度增加到配方上限时，ΔA/min过高，在测定高浓度样本时会使吸光度超过仪器可读上限。实施例三结果显示，反应后期变化较大，当测试高浓度样本时可能会是吸光度达到生化仪检测阈值，各反应物浓度超过实施例3给出的值可能导致吸光度超出仪器检测阈值。从而测试结果不准。因此在表1所给定的浓度范围内，线性和反应灵敏度均能符合要求。

本发明未详述部分为现有技术。