相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统的制作方法

本实用新型涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统。

背景技术：

相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-stokes Raman Scattering，CARS)显微成像技术可以在无需外援性标记的情况下，根据物质分子的振动或者转动特性获得反斯托克斯信号，具有良好的化学特异性以及高灵敏度和高三维层析能力，因此被广泛应用于生物学领域中对脂类分子成像、对蛋白质和核酸进行选择性成像等，为生命科学和物质科学研究提供了灵敏和便利的无标记成像手段。

传统的单频CARS显微成像系统，至少需要两束频差满足分子振动频率的飞秒激光脉冲，且两路光脉冲在时间和空间上完全重合，这是产生CARS信号的必要条件。为能够探测分子不同的特征化学键，需要两束飞秒激光脉冲中至少有一束的波长能够连续改变。目前国际上通常有两种光源方案：

第一，采用两台激光器来产生可调谐飞秒激光作为CARS显微成像技术的光源。由于两台激光器分别由不同的泵浦源进行泵浦，脉冲之间不可避免存在一定的频率差，因此，需要利用外置同步器将两台可调谐激光光源进行主动同步，这样不仅增加了成本，而且不容易维持同步的稳定性，增加了实验的难度。

第二，采用飞秒脉冲泵浦的光学参量放大器(Optical Parametric Oscillator,OPO)作为波长调谐的关键装置。光学参量放大器产生两束与泵浦光脉冲时序完全一致、波长可调谐的信号光与闲频光，通常采用其中的信号光与未耗尽的泵浦脉冲共同激发样品，泵浦光与斯托克斯光的脉冲序列是同步的，可以通过光学时间延迟线使脉冲精确重合，产生CARS信号。但是，这种方案体统庞大，成本很高。

综上，传统的单频CARS技术通过连续改变两束激发脉冲中一束的波长来匹配分子不同化学键的振动频率，以此获得分子内不同化学键的CARS光谱，不仅成像速度缓慢，而且设备昂贵，一定程度上阻碍了CARS显微成像技术的发展。

利用超短激光脉冲泵浦光子晶体光纤产生超连续谱，为这一难题提供了良好的解决方案。然而，泵浦光子晶体光纤需要用到红外飞秒激光脉冲。其中，钛宝石激光器价格高昂且光谱范围很难覆盖到1000nm以上，而近年来发展迅速的光纤激光器波长范围通常在1000nm～1100nm之内，波长不可调谐，且具有平均功率高，体积小，稳定性高，价格低廉的优势。但是，宽带CARS系统中采用光纤激光器的缺点就是没有波长合适的激光脉冲作为的探测光。通常宽带CARS系统中采用光纤激光器，通过光纤激光器输出激光脉冲，然后输出的激光脉冲一分为二，一路泵浦光子晶体光纤，另一路要么直接作为探测光，要么倍频后作为探测光。通常CARS系统中采用的探测光的波长范围在700nm～800nm附近，这个范围的探测光产生的蓝移的CARS信号的波长在500nm～600nm范围内，通常探测器在此范围内的量子效率最高。然而，光纤激光器输出的激光脉冲波长通常介于1000nm～1100nm，倍频后的激光脉冲波长在500nm附近，这两个波长均不适合作为探测光。

技术实现要素：

本实用新型的主要目的在于提供一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统，旨在解决现有技术中基于光纤激光器的宽带相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统没有波长合适的激光脉冲作为探测光的技术问题。

为实现上述目的，本实用新型的技术方案是：相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统，包括：

光纤激光器，用于输出飞秒脉冲激光；

分光单元，用于将所述飞秒脉冲激光分为独立传播的第一光束和第二光束；

光子晶体光纤，设于所述第一光束的光路上，用于经过所述第一光束泵浦以输出超连续谱激光，并将所述超连续谱激光作为斯托克斯光；

第一PPLN晶体，设于所述第二光束的光路上，用于将所述第二光束转化为可调谐的红外激光；

第二PPLN晶体，设于所述第二光束的光路上，用于对所述可调谐的红外激光进行倍频，并将倍频后的所述可调谐的红外激光作为探测光；

延迟单元，设于所述第二光束的光路上，用于使所述斯托克斯光和所述探测光同步；

合束器，用于将同步后的所述斯托克斯光和所述探测光合为第三光束以作用于样品；

光谱仪，用于采集所述样品发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号，以获得所述样品的相干反斯托克斯拉曼散射显微图像。

进一步地，所述光子晶体光纤为全正色散光子晶体光纤。

进一步地，所述全正色散光子晶体光纤的输入端设有用于提高所述第一光束的耦合效率的输入耦合透镜，所述全正色散光子晶体光纤的输出端设有用于提高所述超连续谱激光的输出效率的输出耦合透镜。

进一步地，所述全正色散光子晶体光纤和所述合束器之间设有用于对所述超连续谱激光进行滤波的长波通滤光片。

进一步地，所述合束器的输出光路上设有用于将所述第三光束聚焦于所述样品上的显微物镜。

进一步地，所述样品的光输出方向上设有用于收集所述样品发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号的成像透镜。

进一步地，所述成像透镜和所述光谱仪之间设有用于对所述样品发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号进行滤波的短波通滤光片。

进一步地，所述延迟单元为一对呈90°摆放的反射镜组成的光学时间延迟线。

进一步地，所述光学时间延迟线的延迟时间精度为飞秒级。

进一步地，所述相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统还包括纳米位移台，所述纳米位移台用于动态承载所述样品并配合所述光谱仪联动以实现所述样品的自动扫描。

本实用新型提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统，通过光纤激光器输出的飞秒脉冲激光经分光单元后分为独立传播的第一光束和第二光束，由于本实用新型的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统设置有第一PPLN晶体和第二PPLN晶体，使得第二光束先后经过第一PPLN晶体和第二PPLN晶体，如此，第二光束在第一PPLN晶体和第二PPLN晶体的作用后即可产生脉冲激光，且产生的脉冲激光的波长能够满足CARS系统所需探测光要求的波长范围，从而解决了基于光纤激光器的宽带CARS显微成像系统没有波长合适的激光脉冲作为探测光的技术问题。

附图说明

图1为本实用新型实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统的结构示意图。

图2是本实用新型实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统的CARS信号采集程序界面。

附图标记包括：

1—光纤激光器 2—分光单元 3—光子晶体光纤

4—第一PPLN晶体 5—第二PPLN晶体 6—延迟单元

7—合束器 8—样品 9—光谱仪

10—输入耦合透镜 11—输出耦合透镜 12—光纤固定装置

13—长波通滤光片 14—显微物镜 15—成像透镜

16—短波通滤光片 17—反射镜 18—聚焦透镜

19—波片 20—计算机。

具体实施方式

下面详细描述本实用新型的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。

在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本实用新型的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本实用新型中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。

如图1所示，本实用新型实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统，包括：光纤激光器1，用于输出飞秒脉冲激光；分光单元2，用于将所述飞秒脉冲激光分为独立传播的第一光束和第二光束；光子晶体光纤3，设于所述第一光束的光路上，用于经过所述第一光束泵浦以输出超连续谱激光，并将所述超连续谱激光作为斯托克斯光；第一PPLN晶体4，设于所述第二光束的光路上，用于将所述第二光束转化为可调谐的红外激光；第二PPLN晶体5，设于所述第二光束的光路上，用于对所述可调谐的红外激光进行倍频，并将倍频后的所述可调谐的红外激光作为探测光；延迟单元6，设于所述第二光束的光路上，用于使所述斯托克斯光和所述探测光同步；合束器7，用于将同步后的所述斯托克斯光和所述探测光合为第三光束以作用于样品8；光谱仪9，用于采集所述样品8发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号，以获得所述样品8的相干反斯托克斯拉曼散射显微图像。本实用新型实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统，通过光纤激光器1输出的飞秒脉冲激光经分光单元2后分为独立传播的第一光束和第二光束，由于本实用新型实施例的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统设置有第一PPLN晶体4和第二PPLN晶体5，使得第二光束先后经过第一PPLN晶体4和第二PPLN晶体5，如此，第二光束在第一PPLN晶体4和第二PPLN晶体5的作用后即可产生脉冲激光，且产生的脉冲激光的波长能够满足CARS系统所需探测光要求的波长范围，从而解决了基于光纤激光器1的宽带CARS显微成像系统没有波长合适的激光脉冲作为探测光的技术问题。

其中，PPLN(Periodically-Poled Lithium Niobate，周期极化铌酸锂)晶体是一种高效的波长转换的非线形晶体。本实施例中，采用周期调谐的方式实现波长调谐，并且选择第二光束经过第一PPLN晶体4的晶体转换效率最高的位置，通过OPG(Optical Paramenter Generation，光学参量产生)过程，将单一波长的激光转换为红外波段的可调谐激光，具有宽调谐、高转换效率、结构简单、调谐方便等优点。具体地，第二光束经过第一PPLN晶体4后产生的可调谐的红外激光波长约为1400nm，该可调谐的红外激光经过第二PPLN晶体5倍频后，得到的脉冲激光波长约为700nm。另外，本实施例中，第一PPLN晶体4前后和第二PPLN晶体5前后分别设置有用于使所经过的光束聚焦的聚焦透镜18。

进一步地，所述光子晶体光纤3为全正色散光子晶体光纤3。全正色散光子晶体光纤3在整个可见光和近红外区均无反常色散，该类光纤中超连续谱的展宽主要与光波分裂和自相位调制有关，而激光脉冲在该类光纤中的传输仍保持单脉冲特性，且传输过程没有光孤子产生，因此，传输过程中无脉冲分裂。本实施例中，通过选用第一光束泵浦全正色散光子晶体光纤3，其产生的超连续谱光谱展宽范围大，光谱功率密度稳定，且由于展宽机制单纯，由脉冲压缩后获得的超连续谱激光时谱结构好。当然，在本实用新型的其他实施例中，光子晶体光纤3也可以选用普通光子晶体光纤(具有一个零色散点的光子晶体光纤)和双零色散光子晶体光纤，在此不作唯一限定。

进一步地，所述全正色散光子晶体光纤3的输入端设有用于提高所述第一光束的耦合效率的输入耦合透镜10，所述全正色散光子晶体光纤3的输出端设有用于提高所述超连续谱激光的输出效率的输出耦合透镜11。此外，在分光单元2和输入耦合透镜10之间设有波片19，光子晶体光纤3和输入耦合透镜10之间、光子晶体光纤3和输出耦合透镜11之间分别设有用于固定该光子晶体光纤3的光纤固定装置12。本实施例中，第一光束依次经过波片19、输入耦合透镜10后，耦合进入全正色散光子晶体光纤3，通过泵浦全正色散光子晶体光纤3产生的超连续谱激光，然后生成的超连续谱激光经输出耦合透镜11输出。由于该系统在光子晶体光纤3的输入端和输出端分别设置有输入耦合透镜10和输出耦合透镜11，因此，有效地提高了第一光束的耦合效率和超连续谱激光的输出效率。

进一步地，所述全正色散光子晶体光纤3和所述合束器7之间设有用于对所述超连续谱激光进行滤波的长波通滤光片13。通过在全正色散光子晶体光纤3和合束器7之间设置长波通滤光片13，使得超连续谱激光经过长波通滤光片13滤波后，能够获得预定波长范围的光作为斯托克斯光。

进一步地，所述合束器7的输出光路上设有用于将所述第三光束聚焦于所述样品8上的显微物镜14。在本实施例中，斯托克斯光和探测光于合束器7处合并为第三光束，在合束器7的输出光路上还设有用于将第三光束聚焦于样品8上的显微物镜14，第三光束通过显微物镜14聚焦于样品8上，样品8发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出相干反斯托克斯拉曼散射信号。

进一步地，所述样品8的光输出方向上设有用于收集所述样品8发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号的成像透镜15。在第三光束的作用下，样品8发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号，该相干反斯托克斯拉曼散射信号经过成像透镜15传输至光谱仪9，以实现相干反斯托克斯拉曼散射成像。

进一步地，所述成像透镜15和所述光谱仪9之间设有用于对所述样品8发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号进行滤波的短波通滤光片16。通过在成像透镜15和光谱仪9之间设置短波通滤光片16，一方面可以对样品8发出的相干反斯托克斯拉曼散射信号进行滤波，另一方面也有利于滤除外界的杂散光。

进一步地，所述分光单元2为分束镜，光纤激光器1输出的飞秒脉冲激光经过分束镜后，可有效地被分为独立传播的第一光束和第二光束。此外，本实用新型实施例还包括若干个反射镜17，其分散设置在第一光束和第二光束的光路上，用于调整光路，使之合理紧凑。

进一步地，所述延迟单元6为一对呈90°摆放的反射镜17组成的光学时间延迟线，所述光学时间延迟线的延迟时间精度为飞秒级，所述合束器7为双色镜。具体地，本实施例中采用Newport公司生产的精密线性平台(图未示)来搭配所述光学时间延迟线，且该光学时间延迟线的延迟时间精度可达7fs。通过采用精密线性平台搭配所述光学时间延迟线，可以实现精确控制斯托克斯光和探测光的同步。同步后的斯托克斯光和探测光经双色镜后合为一束，共线输入显微物镜14，调整光轴与显微物镜14的中心轴重合，以保证在相同激发光功率下收集的样品8发出的CARS信号强度最高。其中，CARS信号只产生于焦点处，并且具有良好的方向性，该CARS信号由大数值孔径成像透镜15收集后由芯径为200um的光纤输入至光谱仪9，以进行显微成像。

需要说明的是：在相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统中，延迟单元6可以设置在第一PPLN晶体4和第二PPLN晶体5之前，也可以设置在第一PPLN晶体4和第二PPLN晶体5之后，只要延迟单元6能够使得该系统产生的斯托克斯光和探测光同步即可。

进一步地，所述相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统还包括纳米位移台(图未示)，所述纳米位移台用于动态承载所述样品8并配合所述光谱仪9联动以实现所述样品8的自动扫描。本实施例中，采用Labview程序联动控制Physik Instrumente(PI)公司生产的纳米位移台以及Princeton公司生产的EMCCD光谱仪9，逐点完成样品8三维空间范围内的自动扫描，CARS信号采集程序界面如图2所示。扫描过程中，纳米位移台每移动一步，然后在此位置停留，光谱仪9马上完成该点的光谱数据采集，直至逐点、逐行完成整个目标区域的扫描和数据采集。自动扫描结束后，每一个采样点的位置数据和光谱数据将形成一个二维数组，存放于相同的路径中。点扫描过程记录了每个采样点的位置数据及光谱数据。随后，通过计算机20采用Matlab程序编写成像代码，依次打开指定路径下存储的每一个采样点的位置数据与光谱数据文件，重构具有一定灰度等级的CARS显微图像，如此，便完成了整个数据采集以及图像重构的过程。

综上所述可知本实用新型乃具有以上所述的优良特性，得以令其在使用上，增进以往技术中所未有的效能而具有实用性，成为一极具实用价值的产品。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的思想和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。