本发明涉及基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度，来评价被检者罹患胰脏疾病的可能性的方法。
背景技术：
以被检者体液中的生物分子浓度作为指标，广泛研究了判断癌症等各种疾病罹患有无的方法。例如，专利文献1中公开了：以被检者血液中的csrp1蛋白质的量或csrp1蛋白质有无存在作为指标，来检测被检者的癌的方法。另外，专利文献2中记载了：将血液等体液中的ykl-40浓度与根据年龄调整的临界值进行比较，进行消化道癌有无罹患、严重程度的判定、治疗法的选择等的方法。
十二指肠液是从胰脏排出的胰液、从胆管排出的胆汁、以及在十二指肠中分泌的粘液的混合体液。十二指肠液的采集可以仅通过将内窥镜插入至十二指肠中，在该部位进行吸引即可，与从胰管采集胰液的情况相比，为低侵袭且可以利用更简便的技术实施。因此，通过检测十二指肠液中的胰脏疾病标记物，从而能够检查胰脏疾病(例如参照专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014-115188号公报
专利文献2：日本特表2012-502285号公报
专利文献3：日本特开2015-11011号公报
专利文献4：日本特开2006-308576号公报
非专利文献
非专利文献1：pancreas,1994,vol.9,no.6号,p741-747
非专利文献2：pancreas,2002,vol.24,no.54,p344-347
技术实现要素：
发明要解决的问题
十二指肠液中所含的生物分子的量根据被检者不同而存在较大偏差。因此，在基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度来评价胰脏疾病的罹患可能性时，不考虑被检者的背景等而统一设定将分为目标胰脏疾病的罹患者组和非罹患者组的临界值的情况，判定的精度是不充分的。
即，本发明目的在于提供：基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度，精度更良好地评价胰脏疾病的罹患可能性的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度有被检者的年龄越高浓度越低的倾向，从而完成了本发明。
即，本发明的胰脏疾病的罹患可能性评价方法为下述[1]～[9]。
[1]一种胰脏疾病的罹患可能性评价方法，所述方法具备如下工序：
(a)测定从被检者采集的十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度的工序；
(b)基于在所述工序(a)中测定的前述胰脏疾病标记物的浓度和前述被检者的年龄，来评价前述被检者的胰脏疾病的罹患可能性的工序。
[2]根据前述[1]的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述工序(b)中，进行如下评价：
基于前述胰脏疾病标记物的浓度和前述被检者的年龄计算出评分值，通过对得到的评分值和不依赖于被检者的年龄而统一设定的临界值进行比较，来评价前述被检者的胰脏疾病的罹患可能性；或者
通过对所述胰脏疾病标记物的浓度和根据被检者的年龄层分别设定的临界值进行比较，来评价所述被检者的胰脏疾病的罹患可能性。
[3]根据前述[1]或[2]的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述胰脏疾病标记物是在由胰脏疾病罹患者采集的十二指肠液试样中浓度高于在由胰脏疾病非罹患者采集的十二指肠液试样中浓度的标记物。
[4]根据前述[1]的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述胰脏疾病标记物是在由胰脏疾病罹患者采集的十二指肠液试样中浓度高于在由胰脏疾病非罹患者采集的十二指肠液试样中浓度的标记物，
在前述工序(b)中，基于前述胰脏疾病标记物的浓度和前述被检者的年龄，算出评分值，
该评分值为不依赖于被检者的年龄而统一设定的临界值以上时，评价为前述被检者发生胰脏疾病的可能性高，该评分值低于前述临界值时，评价为前述被检者发生胰脏疾病的可能性低。
[5]根据前述[4]的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述工序(a)中测定的前述胰脏疾病标记物的浓度和前述评分值p满足下述式(1)的关系。
(1)log〔p/(1-p)〕＝a×log10[胰脏疾病标记物浓度]+b×[被检者的年龄]+c
[式(1)中，a、b和c是通过将由胰脏疾病罹患者组和胰脏疾病非罹患者组采集的十二指肠液试样中的前述胰脏疾病标记物的浓度和年龄作为解释变量的多元逻辑回归(multiplelogisticregression)分析而确定的实数。]
[6]根据前述[1]的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述胰脏疾病标记物是在由胰脏疾病罹患者采集的十二指肠液试样中浓度高于在由胰脏疾病非罹患者采集的十二指肠液试样中浓度的标记物，
前述工序(b)中，前述胰脏疾病标记物的浓度为预先根据年龄层分别设定的临界值以上时，评价为前述被检者发生胰脏疾病的可能性高，前述胰脏疾病标记物的浓度低于前述根据年龄层分别设定的临界值时，评价为前述被检者发生胰脏疾病的可能性低。
[7]根据前述[6]的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述根据年龄层分别设定的临界值以年龄层越高该值越低的方式设定。
[8]根据前述[1]～[7]中任一项所述的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述胰脏疾病标记物为s100蛋白质。
[9]根据前述[1]～[8]中任一项所述的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，其中，前述胰脏疾病为胰腺癌。
发明的效果
尽管十二指肠液试样是个体差异大的生物体试样，但利用本发明的胰脏疾病的罹患可能性评价方法，能够以高精度、尤其是在将65岁以上的高龄者作为被检者时能高特异性地实施基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度的胰脏疾病的罹患可能性的评价。
附图说明
图1是实施例1中，由各患者的s100p浓度的常用对数值制作的roc曲线。
图2是示出实施例1中，对于1a+1b组(左图)和0/i+iia组(右图)，根据患者年龄绘制s100p浓度的测定值的结果的图。
图3是实施例1中，由组合了各患者的s100p浓度的常用对数值和年龄而得到的评分值而制作的roc曲线。
具体实施方式
在本发明和本申请说明书中，胰脏疾病标记物是胰液中所含的蛋白质、核酸、脂质、细胞等各种生物分子，是胰脏疾病罹患患者与胰脏疾病的非罹患者相比较，胰液中的浓度显著增高的生物分子。需要说明的是，胰脏疾病的非罹患者只要胰脏正常即可，不限定于健康者，还包括胰脏疾病以外的疾病的罹患者。另外，作为胰脏疾病，例如可列举出：胰腺癌、ipmn(胰管内乳头粘液性肿瘤)、mcn(粘液性囊腺瘤)、scn(浆液性囊腺瘤)、net(胰腺内分泌肿瘤)、慢性胰腺炎(cp)、急性胰腺炎等。
在本发明和本申请说明书中，临界值是指：对于胰脏疾病标记物的浓度或由该浓度导出的值，分为目标胰脏疾病的罹患者组和非罹患者组的值。考虑胰脏疾病标记物的种类、胰脏疾病标记物的浓度的测定方法等，可以实验性地设定分为胰脏疾病的罹患者组和非罹患者组的临界值。作为临界值的设定方法的一个例子，例如：首先，对于由已知胰脏未罹患的足够数量的被检者采集的十二指肠液、以及由已知该疾病罹患的足够数量的被检者采集的十二指肠液分别测定胰脏疾病标记物的浓度。接着，对于得到的测定值或由该测定值导出的评分值，制作roc曲线(观测者操作特性曲线：receiveroperatorcharacteristiccurve)。可以基于该roc曲线以获得目标灵敏度和特异性的方式对临界值进行设定。
为了评价胰脏疾病的罹患可能性，优选使特异性为80％以上的方式进行设定临界值、更优选使特异性为85％的方式进行设定临界值、进一步优选使特异性为90％以上的方式进行设定临界值。
本发明的胰脏疾病的罹患可能性评价方法(以下有时称为“本发明的评价方法”。)是将十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度作为指标对胰脏疾病的罹患可能性进行评价的方法。具体而言，该方法具备下述工序(a)和(b)。
(a)测定从被检者采集的十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度的工序。
(b)基于前述工序(a)中测定的前述胰脏疾病标记物的浓度和前述被检者的年龄，来评价前述被检者的胰脏疾病的罹患可能性的工序。
如后述实施例所示，十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度对于胰脏疾病非罹患者而言有被检者的年龄越高浓度越低的倾向。其理由尚未明确，但可推测出：由于胰脏功能降低而使从胰管排出胰液量本身降低，结果导致十二指肠液中所含的胰液量本身降低。
根据该十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度与年龄的关系，针对全部年龄层统一设定临界值时，根据被检者的年龄层不同而精度存在偏差，从而评价精度降低。即，在针对全部年龄层统一设定临界值时，年龄较低的层虽然灵敏度高但特异性低，从而假阳性增多。相反，年龄较高的层虽然特异性高但灵敏度低，有假阴性增多的倾向。
因此，为了提高基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度来评价胰脏疾病的罹患可能性时的评价精度而得到可靠性更高的评价结果，本发明的评价方法中，基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度和被检者的年龄这两者，对被检者的胰脏疾病的罹患可能性进行评价。考虑到胰脏疾病标记物浓度由年龄增长所导致的自然降低部分，通过用被检者的年龄对十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度进行校正，从而可提高评价精度。
例如，通过基于十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物的浓度和采集了试样的被检者的年龄而计算出试样的评分值，将得到的评分值与不依赖于被检者的年龄而统一设定的临界值进行比较，从而对被检者的胰脏疾病的罹患可能性进行评价。通过对胰脏疾病标记物的浓度进行考量了被检者的年龄的评分值化，从而在与将全部年龄层作为对象的统一临界值进行比较的情况下，也可抑制由于年龄层不同而产生的精度偏差，对于任意的年龄层均能够实现相同程度的灵敏度和特异性。对于将全部年龄层作为对象的临界值，可以基于针对在统计学上具有足够数量的胰脏疾病罹患者的评分值和同样地在统计学上具有足够数量的非罹患者的评分值制作的roc曲线，以灵敏度和特异性成为期望的范围的方式进行设定。
对于针对胰脏疾病标记物的浓度考虑了年龄的评分值p，例如在胰脏疾病标记物浓度的常用对数值中，以补充因加龄而使胰脏疾病标记物浓度降低部分的方式进行设定。具体而言，例如，评分值p可以按满足下述式(1)关系的方式进行设定。
(1)log〔p/(1-p)〕＝a×log10[胰脏疾病标记物浓度]+b×[被检者的年龄]+c
式(1)中，a、b和c是通过将由胰脏疾病罹患者组和胰脏疾病非罹患者组采集的十二指肠液试样中的前述胰脏疾病标记物的浓度和年龄作为解释变量的多元逻辑回归分析而确定的实数。多元逻辑回归分析可以依据常规方法进行。设定式(1)时进行的多元逻辑回归分析的标本优选使用：分别由在统计学上具有足够数量的胰脏疾病罹患者和相同在统计学上具有足够数量的非罹患者采集的十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物浓度。
例如，式(1)中，通过将a设为1.5～2.2、优选设为1.7～1.9，将b设为0.1～0.2、优选设为0.12～0.17，将c设为-20～-15，从而能够在全部年龄层中将特异性调整为80％以上、优选调整为90％以上。
例如，胰脏疾病标记物为在由胰脏疾病罹患者采集的十二指肠液试样中浓度高于在由胰脏疾病非罹患者采集的十二指肠液试样中浓度的标记物时，根据被检者的十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物浓度和年龄并基于式(1)计算出评分值p，得到的评分值p为不依赖于被检者的年龄而统一设定的临界值以上时，评价为该被检者发生胰脏疾病的可能性高，得到的评分值p低于该临界值时，评价为该被检者发生胰脏疾病的可能性低。
工序(b)中，还可以使用根据被检者的年龄层不同来对分为目标胰脏疾病的罹患者组和非罹患者组的临界值进行了设定后的值。对于根据年龄层不同的临界值，以年龄层越高则临界值越低的方式进行设定。对于划分临界值进行设定的年龄层，可以均等划分恒定年龄幅度地进行设定，还可以不均等划分恒定年龄幅度地进行设定。例如，可以将从0岁至全部年龄分为每5岁、每10的年龄层来进行设定、或分别汇总低于50岁的年龄层和70岁以上的年龄层，均等划分恒定年龄层地设定50～69岁。
例如，胰脏疾病标记物为在由胰脏疾病罹患者采集的十二指肠液试样中浓度高于在由胰脏疾病非罹患者采集的十二指肠液试样中浓度的标记物时，胰脏疾病标记物的浓度为预先根据年龄层分别设定的临界值以上时，评价为该被检者发生胰脏疾病的可能性高，胰脏疾病标记物的浓度低于根据年龄层分别设定的临界值时，评价为该被检者发生胰脏疾病的可能性低。
本发明的评价方法中作为指标的胰脏疾病标记物只要是与胰脏疾病未罹患患者相比较，胰脏疾病罹患患者的胰液中的浓度显著增高的生物分子即可，没有特别限定。本发明中，胰脏疾病标记物优选为不易受到糖蛋白、酶等十二指肠液中所含的消化酶影响的生物分子。作为本发明的评价方法中作为指标的胰脏疾病标记物，可列举出：s100蛋白质(s100p)、ngal、mic-1、cea、ca19-9(例如，参照非专利文献1。)、muc-1(kl-6)(例如，参照专利文献4等)、mmp2(基质金属蛋白酶-2：matrixmetalloproteinase-2)(例如，参照非专利文献2)、mmp7(基质金属蛋白酶-7：matrixmetalloproteinase-7)等。其中，优选如s100p、ngal、mic-1、cea等那样，在所评价的目标胰脏疾病罹患的被检者中，胰液中的浓度显著高于非罹患者的物质、特别优选s100p。例如，s100p在胰腺癌细胞中的分泌增大，因此通过将s100p作为胰脏疾病标记物，从而能够以高可靠性评价难以早期发现且被认为预后非常差的胰腺癌的罹患可能性，甚至可有助于胰腺癌的早期发现。
在工序(a)中，供于本发明的评价方法的十二指肠液试样可以是从被检者采集的十二指肠液本身，还可以是向采集的十二指肠液中添加了各种添加剂、缓冲剂等的物质。作为添加剂，可列举出：表面活性剂、蛋白质分解酶抑制剂、核酸分解酶抑制剂、ph调整剂等、用于抑制十二指肠液试样中的成分的分解、变性的试剂等。作为缓冲液，可以使用：磷酸生理盐水(pbs)、hepes缓冲剂等之类的、在用于检测蛋白质、核酸的反应液制备中使用的缓冲剂。对于添加剂等，可以添加至包含由生物体采集的十二指肠液的容器中，还可以预先放入容器中，在该容器中直接采集十二指肠液。
十二指肠液可以利用常规方法由被检者采集。例如可以通过与内窥镜导管连接的注射器、真空泵等的吸引手段采集十二指肠液。具体而言，将内窥镜从口腔插入至十二指肠中，贯穿钳子通道并使用插入的导管，对存在于十二指肠的第二/第三部分的十二指肠液进行吸引、采集。例如，还可以在进行作为所谓胃镜的胃/十二指肠的内窥镜检查(上部内窥镜检查)之后，采集储存在十二指肠的肠管内的十二指肠液。
供于工序(a)的十二指肠液试样可以是刚由被检者采集的物质，也可以是通过室温、冷藏或冷冻保存后的物质，还可以是通过冷冻干燥处理而得到的冷冻粉末。另外，对于十二指肠液试样，还可以利用离心分离处理等分离去除细胞等的固体成分之后供于工序(a)。
工序(a)中，测定十二指肠液试样中的胰脏疾病标记物浓度的方法只要是可以定量或半定量地检测试样中的胰脏疾病标记物的测定方法就没有特别限定。例如，可以通过使用了elisa、免疫色谱法、二维电泳、免疫印迹、质谱分析法等的各种蛋白质解析；使用了pcr、rt-pcr、应用了探针的杂交分析法等的各种核酸解析等对各种胰脏疾病标记物进行定量或半定量地检测。另外，通过使用生化学自动分析装置等各种分析装置，从而能够对于多个十二指肠液试样迅速且容易地进行胰脏疾病标记物的定量或半定量的检测。这些方法可以利用常规方法进行。
实施例
接着示出实施例等对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不限定于以下的实施例。
[实施例1]
将2个医疗设施的患者中、s100p浓度为检测界限值以上(超过0)的50岁以上的、且没有胰脏疾病或者胰腺癌为0阶、i阶、或者iia阶的男女总计71名作为对象，对于十二指肠液试样中的s100p浓度和胰腺癌罹患的有无进行了统计学解析。需要说明的是，低于50岁的患者中，胰腺癌罹患的概率非常低，因此排除在本实验之外。s100p浓度为检测界限值以上(超过0)的患者有296名，其中50岁以上有254名、低于50岁有42名。
将这些患者分为：没有胰脏疾病并且也没有胰腺癌的家庭病史的患者组(1a组)；没有胰脏疾病、但有胰腺癌的家庭病史的患者组(1b组)；早期(0阶和i阶)胰腺癌的患者组(0/i组)、iia阶胰腺癌的患者组(iia组)。
使用circulexs100pelisakit(cyclex公司制、目录编号：cy-8060)测定由各患者采集的十二指肠液试样中的s100p浓度(pg/ml)。对于s100p浓度的测定值，为了求出识别没有胰脏疾病的患者组(1a组和1b组的总计；1a+1b组)和胰腺癌患者组(0/i组和iia组的总计；0/i+iia组)的临界值，由各患者的s100p浓度制作了roc曲线，结果roc曲线下的面积(auc)保持在0.7037(95％可靠区间：0.5787～0.8038)(图1)。
对于1a+1b组和0/i+iia组，将绘制了根据患者的年龄的s100p浓度的测定值的结果示于图2。其结果，在胰脏正常的1a+1b组中，观察到年龄越高s100p浓度越低的倾向。
因此，分别将在s100p浓度(pg/ml)的常用对数值(log10[胰脏疾病标记物浓度(pg/ml)])、年龄、性别、设施、糖尿病的有无、食道疾病的有无、吸烟史中的每一个作为逻辑/模型的解释变量，调查了与胰腺癌阶段(1a+1b组或0/i+iia组)的相关性。将各解释变量中的比值比(oddsratio)和95％可靠区间、p值示于表1。表中，“log10(s100p)”表示s100p浓度的常用对数值。其结果，胰腺癌阶段与s100p的对数变换值、年龄和糖尿病的有无在统计学上显示出显著地相关性，与性别、设施、食道疾病的有无、吸烟史在统计学上无显著地相关性。
[表1]
＜评分值＞
尤其从s100p浓度的常用对数值与年龄的相关性较强、糖尿病与年龄相关方面考虑，可认为胰腺癌阶段与糖尿病的相关性介由年龄的相关性的可能性。因此，尤其在关注年龄，进行将s100p浓度的常用对数值和年龄作为解释变量的多元逻辑回归，结果可得到由下述式(2)表示的评分值p1。
(2)log〔p1/(1-p1)〕＝1.82272×[s100p浓度(pg/ml)的常用对数值]+0.13753×[被检者的年龄(岁)]-18.2273
使用得到的评分值p1来制作roc曲线，结果auc增加至0.8243(95％可靠区间：0.7197～0.9082)(图3)。另外，为了以特异性90％评价胰腺癌罹患的有无，只要评分值为0.634974即可，此时的灵敏度为51.85％。
接着，在逻辑/模型中，在s100p浓度的常用对数值和年龄中以全部组合的方式分别投入上述3个变量(设施、糖尿病、食道疾病)中的1个以上。基于通过各组合而得到的评分值制作roc曲线，求出auc。将基于加入了前述3个变量的逻辑回归模型而得到的auc与由通过s100p浓度的常用对数值和年龄这2个变量得到的auc的差的检验结果示于表2。其结果可知：与由根据s100p浓度的常用对数值和年龄这2个变量进行的逻辑/模型得到的roc曲线的auc相比，均未出现在统计学上显著地增加，因此通过组合s100p浓度的常用对数值和年龄，能够精度良好地评价胰腺癌罹患的有无。
[表2]
＜每个年龄层的临界值的设定＞
将前述71名患者分为50～59岁的年龄层、60～69岁的年龄层、70岁以上层，根据各自的年龄层由s100p浓度制作roc曲线，以特异性为90％左右的方式确定临界值，求出灵敏度。另外，对于全部年龄层(50岁以上的年龄层)，也由s100p浓度制作roc曲线，以特异性为90％左右的方式确定临界值，求出灵敏度。进而，对于50～59岁的年龄层、60～69岁的年龄层、70岁以上层，计算出将临界值设为用全部年龄层求出的临界值(统一临界值)时的灵敏度和特异性。将结果示于表3。表中，“50-59”表示50～59岁的年龄层、“60-69”表示60～69岁的年龄层、“70-”表示70岁以上的年龄层、“50-”表示50岁以上的年龄层。
[表3]
对使用统一确定临界值情况下的临界值(137116pg/ml)时的灵敏度和特异性、与根据年龄层不同以特异性为90％左右的方式确定临界值时的灵敏度和特异性进行比较，50～59岁的年龄层没有差异；但60岁以上的年龄层中，根据年龄层分别确定临界值时得到了更高的检查性能。60～69岁的年龄层中，根据年龄层确定临界值时得到了高的特异性。70岁以上的年龄层中，统一临界值时虽然特异性增高但灵敏度骤减，不过根据年龄层确定的临界值时，灵敏度和特异性均良好。
将60～69岁的年龄层分为60～64岁的年龄层和65～69岁的年龄层，根据各自的年龄层、由s100p浓度制作roc曲线，以特异性为90％左右的方式确定临界值，求出灵敏度。将结果示于表4。表中，“60-64”表示60～64岁的年龄层、“65-69”表示65～69岁的年龄层、“70-”表示70岁以上层。其结果，60～64岁的年龄层与50～59岁的年龄层同样地，使用统一临界值时与根据年龄层设定临界值时没有差异，但在65～69岁的年龄层中，与统一临界值相比，根据年龄层确定时得到了高的特异性。
[表4]